FacMed. 3emeAnnéemed 4eme anneephar 2016/17 MicrobiologiE ALLAG H FacMed.3emeAnnéemed 4eme anneephar 2016/17 MicrobiologiE ALLAG H. Structures bactériennes et classification simplifiée.

Historique (I) 1676 : Van Leeuwenhoek : microscope « Génération spontanée » Début XIXè siècle : Pasteur, (1) notion de micro- organisme, (2) ces micro-organismes peuvent provoquer des maladies Milieu XIXè : Lister, stérilisation 1876 : Koch, notion de maladie bactérienne, 4 postulats de Koch

Historique (II) « age d’or de la microbiologie » : Koch : charbon (Bacillus anthracis), tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), choléra (Vibrio cholerae) Klebs/Loeffler : diphtérie (Corynebacterium diphtheriae) Shiga : dysenterie (Shigella dysenteriae) Kitasato/Yersin : peste (Yersinia pestis) Vaccins : Jenner : variole/vaccine Pasteur : choléra des poules, rage Von Behring/Kitasato : antitoxine (diphtérie) Anatoxines

Microscope de van Leeuwenhoek

MORPHOLOGIE ET STRUCTURE DES BACTERIES Définition Moyens d’étude microscopie optique microscopie électronique Anatomie bactérienne taille morphologie ; classification schéma général enveloppes : paroi • peptidoglycane • ≠ Gram + / Gram - membrane cytoplasmique constituants internes : cytoplasme appareil nucléaire éléments inconstants

Définition BACTERIE : être vivant unicellulaire, de petite taille (1 à qq µm de longueur) = cellule procaryote (sans véritable noyau) ≠ cellule eucaryote paroi rigide, contient un constituant spécifique : le peptidoglycane

Agents des maladies infectieuses Prions : maladies dégénératives du système nerveux (maladie de Creutzfeldt Jakob) Virus : 20 – 200 nm Bactéries Champignons Parasites

Moyens d’étude microscope optique état frais : entre lame et lamelle forme mobilité frottis fixé et coloré meilleure appréciation de la morphologie (X 1000) nombreuses méthodes : GRAM +++ Giemsa P.A.S., etc. microscope électronique plusieurs technique : transmission, balayage... étude des structures superficielles, de l’architecture interne travaux de recherche uniquement (X 200 à X 400)

Qu’est ce qu’une bactérie ? Bactérie = être vivant, unicellulaire Poids d’une cellule = 10 puissance-12 g (poids sec = 3x10-13 g) • Découverte du monde bactérien : début du 18ème siècle grâce au microscope • Étude des bactéries : Louis Pasteur (1822-1895) découverte du rôle des bactéries dans -les fermentations - les maladies • Classement : Eucaryotes : membrane nucléaire (algues, champignons, protozoaires) Procaryotes : un seul chromosome, pas de membrane nucléaire toujours unicellulaire (bactéries, algues bleues)

Domaines de la bactériologie Science médicale : pathologie infectieuse Science fondamentale : bactéries et virus = outils en génétique et biologie moléculaire Science extra-médicale concernant : - L’agriculture : bactéries interviennent dans cycles naturels de C, N, S - L’industrie alimentaire : . rôle dans les fermentations . contamination des aliments (Salmonelles, Listéria) - L’industrie chimique et pharmaceutique : . production d’antibiotiques . armes de guerre

Moyens d’étude de la structure bactérienne A) microscopie optique (x 1000 à 1500) morphologie, groupement Coloration de Gram inventée en 1884 ®violet : Gram + ®rose : Gram – B) microscopie électronique (x > 10 000) structure fine des bactéries C) fractionnement des bactéries Constituants libérés, séparés, analysés

Anatomie bactérienne microscopie optique taille de 1 à quelques µm ex. staphylocoque 1 µm Escherichia coli 3 µm hématie 7 µm morphologie : 3 formes principales chez les bactéries d’intérêt médical

Morphologie bactérienne 1)• forme : - coques = sphères - bacilles = bâtonnets - spirilles 2)• taille : ~1 μ de large x quelques μ de long 3)• groupement des bactéries caractéristique de l’espèce :isolées, par 2, amas, chaînettes, en palissades… 4)Combinaison entre - forme, caractérise les bactéries - coloration - et groupement

1 - sphérique : coques ou cocci isolées en paire = diplocoques pneumocoques méningocoques en amas staphylocoques en tétrades microcoques en chaînettes streptocoques

Taille, forme, et arrangement Coques: sphères diplocoques: paires de coques Streptocoques: chaînes de coques Staphylocoques: organisation en grapes Tétrades: 4 coques en un groupe carré Genre Sarcina: aglomérat cubique de 8 coques Exemple de streptocoques

2 - bâtonnets : bacilles Bacillus Listeria corynébactéries Actinomyces Clostridium palissades ou lettres de l’alphabet

entérobactéries coloration bipolaire Haemophilus Pseudomonas Acinetobacter vibrions

3 - spirales = spirilles ou spirochètes tréponème (Treponema pallidum) syphilis Borrelia burgdorferi maladie de Lyme Leptospira spp. leptospirose

Streptocoques corynébactéries

Bacillus

Méningocoque (LCR)

Gonocoque (prélèvement urétral)

Bactérie spiralée en microscopie à fond noir (Borrelia)

Bacille à gram négatif à coloration bipolaire (Yersinia)

Anatomie bactérienne (cellule procaryote) Eléments obligatoires : Eléments inconstamment présents : - chromosome - plasmides - cytoplasme - vacuoles, substances de réserve - ribososomes - capsule - membrane cytoplasmique - flagelles - paroi - pili (pilus commun et pilus sexuel) - spore Eléments absents : * véritable noyau * mitochondrie * réticulum endoplasmique * appareil de Golgi

Constituants de la cellule bactérienne • Rôle pour la bactérie • Implications médicales dans - pouvoir pathogène - diagnostic biologique (direct et indirect) - études épidémiologiques (comparaison de souches) - sensibilité aux antibiotiques - vaccins

Structures constantes Paroi Membrane cytoplasmique Appareil nucléaire Cytoplasme Structures inconstantes Capsule Couche S Flagelles Fimbriae, Pili Spore Eléments génétiques mobiles

A)Chromosome - absence de membrane nucléaire - filament unique d’ADN . bicaténaire . circulaire . surenroulé - 1000 fois plus long que la bactérie (masse ~ 2000MDa) - protéines fixées dessus: - ADN et ARN polymérases - topoisomérases : réalisent les torsades

A’)Chromosome : intérêt médical Identification bactérienne : mise en évidence de gènes Épidémiologie : comparaison des génomes des souches bactériennes Cible d’antibiotiques : - quinolones : inhibition des topoisomérases - rifamycine : inhibition de l’ARN polymérase (=> de la transcription) - nitro-imidazolés : fragmentation de l’ADN

B)Plasmides structures génétiques non essentielles (inconstantes) ADN double brin, surenroulé de 1 à 1000 kb (en moyenne 0,5 à 5% de la taille du chromosome) cytoplasmique, de réplication autonome transférable à d’autres bactéries par conjugaison exemples : - plasmides porteurs de gènes intervenant dans le pouvoir pathogène(gènes de virulence, de toxines…) - plasmides de résistance aux antibiotiques - Facteur F transfert de fragments de chromosome par conjugaison.

C)Cytoplasme composés solubles composés de réserve ARN ribosomes

D)Ribosomes • Nombreux : ~ 20 000 / bactérie • Constitution : -comportent 2 sous unités (50S et 30S) constituées de protéines + ARN (23S et 16S) • Rôle dans la synthèse protéique • Cible d’antibiotiques qui agissent en perturbant la synthèse protéique - aminosides - cyclines - phénicolés - macrolides - acide fusidique.

E)Membrane cytoplasmique interface entre cytoplasme et structures externes sous la paroi • Constitution - protéines dispersées dans - double couche de phospholipides absence de cholestérol -micro. électronique : aspect trilamellaire Lieu de fixation des flagelles et d’initiation de leur mouvement

E’)Membrane cytoplasmique : -nombreuses fonctions • Responsable des échanges - transferts passifs : barrière osmotique - pénétration active et sélective : perméases - sortie des protéines : systèmes de sécrétion • Transmission des informations de l’environnement : protéine signal • Enzymes de la chaîne respiratoire (même rôle que la mitochondrie dans la cellule eucaryote) • Cible de substances antibactériennes : - phénols, antiseptiques cationiques - antibiotiques polypeptidiques : fixation sur les phospholipides

F)Paroi enveloppe rigide forme (exosquelette) protection contient la pression osmotique interne différente chez les Gram positif et les Gram négatif mais comporte un polymère commun, partie la plus interne : PEPTIDOGLYCANE = MUREINE = MUCOPEPTIDE macromolécule (= sac entourant la bactérie) de structure réticulée : - chaines polysaccharidiques reliées par des - chainons peptidiques

La paroi et les groupes bactériens Paroi d’une cellule Gram-positive Paroi d’une cellule Gram-négative Paroi cellulaire Peptidoglycane Membrane plasmique Membrane externe Peptidoglycane Membrane plasmique Paroi cellulaire Espace périplasmique

F’)Paroi : peptidoglycane ou muréine · constitution : - chaines polysaccharidiques . acide N-acétyl muramique = NAM . N-acétyl glucosamine = NAG - chainons peptidiques . branchés sur l’acide muramique (NAM) . et reliés entre eux par une chaîne peptidique · biosynthèse : - enzymes (transpeptidase, carboxypeptidase) sur lesquelles se fixent les AB béta-lactamines = protéines se liant à la pénicilline ou PLP

F’a)Paroi chez les GRAM POSITIF : épaisse (30 à 50 nm) peptidoglycane = constituant majeur (30% du poids sec), -nombreuses couches - autres constituants fixés dans le peptidoglycane : - acides teichoïques - polysaccharides - protéines - la mb. Cytoplasmique.

F’b)Paroi chez les GRAM NEGATIF : plus complexe peptidoglycane : couche mince (3-5 nm) (< 15% du poids sec) espace périplasmique membrane externe : - double couche de phospholipides - couche externe de lipopolysaccharide (LPS) - protéines : - de structure (OmpA) - de transport - porines : perméabilité - d’adhérence

F’c)Paroi des GRAM NEGATIF : structure du LPS couche externe de lipopolysaccharide (LPS) = endotoxine, avec 3 régions : • lipides (lipide A) • rattachés au core ou noyau polysaccharidique de base • sur lequel est fixé un polysaccharide complexe immunogène (antigène O) se développant à l’extérieur de la paroi

Mb externe des Gr-: le LPS LPS = endotoxine = Ag O - Composé de 3 parties: -Lipide A -Polysaccharide central -Chaîne O

F’d)Intérêt médical de la paroi bactérienne Des fragments des divers constituants ont un rôle dans : • activation des macrophages (muréine, ac lipoteichoïque, LPS) plus forte production de cytokines endotoxine en grande quantité choc toxique • activation de la voie alterne du complément, attraction des phagocytes sur les sites infectieux • activité antiphagocytaire • adhérence (protéines associées, ac lipoteichoïques) • immunogènicité • variantes antigéniques sérotypage des bactéries (épidémiologie) Site d’action • d’antiseptiques • d’antibiotiques agissant sur : - la synthèse de la paroi : - béta-lactamines (liaison avec les PLP) - fosfomycine - glycopeptides - la partie phospholipidique : polymyxines (colistine)

G)Capsule élément le plus superficiel inconstante polysaccharidique (polymère de 1-2 sucres) mise en évidence à l’encre de chine halo clair Implications médicales : • Pouvoir pathogène : la résistance à la phagocytose (pneumocoque) • Diagnostic : antigènes solubles dans les liquides de l’organisme • Épidémiologie : typage sérologique (pneumocoque, hémophile) • Vaccins : à base de polymères capsulaires purifiés (pneumocoque, Haemophilus influenzae)

H)Flagelles · colorations spéciales en microscopie optique · assurent la mobilité de certaines bactéries · colorations spéciales en microscopie optique - longueur : 6 à 15 μm - nombre variable suivant les espèces : 1 ou plus - disposition variable - péritriche (autour de la bactérie) - polaire (à 1 ou aux 2 extrémités) · assemblage de protéines : flagellines · attachés à la membrane cytoplasmique par une structure protéique mobile par rotation · flagellines sont antigéniques - sérotypage - sérodiagnostic (fièvre typhoïde)

I)Pili sexuels peu nombreux (1 à 4) longs - creux - extrémité distale renflée codés par des gènes plasmidiques (facteur F) rôle dans la conjugaison bactérienne : rapprochement des 2 bactéries male et femelle échange de matériel génétique

J)Pili communs ou Fimbriae • structure fibrillaire protéique, fine, 4 à 8 μm de long • visibles uniquement en microscopie électronique rigides, régulièrement disposés à la surface ancrés dans membrane externe de la paroi • facteurs de pathogénicité : . adhésion aux cellules eucaryotes, favorise la colonisation des muqueuses : - épithélium urinaire : colibacilles uropathogènes - entérocytes : colibacilles entéropathogènes - épithélium urogénital : gonocoque . protection contre la phagocytose

K)Glycocalyx Biofilm Exopolymère : feutrage de fibres polysaccharidiques = structure réticulée lâche Propriétés d’adhésion responsable de l’attachement : ⇒ des bactéries entre elles ⇒ entre bactéries et corps étrangers (biomatériaux, cathéters, prothèses) ⇒ entre bactéries et surfaces cellulaires (respiratoires) : facteur de colonisation ⇒ entre bactéries et valves cardiaques : végétations et endocardite ⇒ entre bactéries et émail dentaire : plaque dentaire puis carie Biofilm = ensemble structuré de bactéries, enveloppées dans une matrice de polymère autoproduit, qui s’amarre sur des surfaces inertes ou vivantes

L)SPORE FORME DE RESISTANCE de certaines bactéries quand les conditions deviennent défavorables - ronde ou ovale - paroi très épaisse - résiste . au froid. à la chaleur. à la dessication. aux antibiotiques . à certains antiseptiques - conservation de toutes les aptitudes génétiquement déterminées - peut persister très longtemps dans l’environnement et redonner une forme végétative quand les conditions redeviennent favorables exemples de bactéries sporulées : Bacillus anthracis Clostridium perfringens Clostridium botulinum Clostridium tetani Clostridium difficile.

L’endospore bactérienne Formée par certaines bactéries Gram- positives. Dormance Résistante aux conditions sévères de l’environnement: Chaleur Radiations ultraviolettes Désinfectants chimiques Dessiccation Spore centrale Spore subterminale Spore terminale Spore terminale avec sporange gonflé

spore : forme de résistance de certaines espèces permet la survie dans des conditions défavorables (froid, dessication...) redonne des formes végétatives quand des conditions favorables se manifestent à nouveau propriétés : thermorésistance : 100°C, 20 min résistance aux radiations (U.V.) résistance aux antibiotiques, à certains antiseptiques différentes formes : centrale non déformante subterminale déformante terminale déformante (Bacillus cereus) (Clostridium perfringens) (Clostridium tetani)

M)Cibles d’action des principales famille d’antibiotiques ► Paroi : - Bêta-lactamines (PLP) - Glycopeptides - Fosfomycine ►Membrane cytoplasmique : -Polymyxines ►Ribosomes : - Aminosides - Phénicols - Cyclines - Macrolides - Acide Fusidique ►ADN : - Rifamycines (ARN polymérase) - Quinolones (topo-isomérases) - Sulfamides et apparentés (synthèse des acides nucléiques) - Nitroimidazolés( Flagyl*) FIN 2016/17. ALLAG H. FacMed3/4emeanMED/PHAR.Microbiologie.

MERCI POUR VOTRE ATTENTION. fin