Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine GUILBOT Nils ISMAN Julien KONCKI Arielle POMATTO Laurianne POUJOL Julie Molécule de créatinine Source: wikipédia Test papier pH Source: www.teesfrance.com Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Plan Qu’est ce que la créatinine? La détection de la créatinine La réaction de Jaffé Test de dépôt sur papier Test de dépôt sur microbilles Test sur gel d’agarose Bilan, perspective et coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

I. Qu’est ce que la créatinine? Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Qu’est ce que la créatinine? Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Qu’est ce que la créatinine? Taux constant, hors effort Dégradation par les reins et évacuation dans l’urine Concentration sanguine faible (30 mg/L) Gamme de valeurs de concentration chez l’homme : Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

II. La détection de la créatinine Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Pourquoi vouloir détecter la créatinine? L’insuffisance rénale 3 millions de personnes touchées La filtration glomérulaire n’est plus assurée Augmentation de la créatinine sanguine Diminution de la clairance Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Comment on la détecte? Où trouve-t-on la créatinine? Sang : méthode actuelle Urine : on doit détecter une diminution de la clairance Salive : méthode la plus simple Actuellement, on mesure la créatinine par voie sanguine Méthode invasive Problèmes à long terme Obligation de faire appel au personnel médical Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Avantage de détecter la créatinine dans la salive Méthode non invasive Aucun problème de contamination Possibilité de faire le test soi même, à la maison Résultat quasi immédiat Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Objectifs initiaux Trouver une méthode de mesure de la créatinine Moins invasive Moins contraignante Moins chère Test papier Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

III. La réaction de Jaffé Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

La réaction de Jaffé Simple Avec une cinétique de réaction Mais réaction sensible à différents facteurs (sérum: drogue, glucose ….) Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

La Gamme de concentration Nécessité d’avoir 1/3 créatinine 1/3 acide picrique 1/3 soude Volume puits: 200µL Cinétique: 15 minutes Extension de la gamme Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

La Gamme de concentration Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

La Gamme de concentration Décalage de la gamme de concentration => zone à risque dans la zone de virage de la couleur. Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

La Gamme de concentration Gamme décalée Mais écart réduit Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

V. Test de dépôts sur papier Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Test de dépôts sur papier Objectifs : Etude du comportement des liquides sur les différents papiers Détermination d’un papier optimal pour la réaction Etude de la réaction : visualisation de la couleur Protocole expérimental : Dépôt d’une goutte de 10 μL de picrate Choix du papier optimal pour la réaction Dépôt d’une goutte de 5μL de créatinine à 800 μM Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Test de dépôts sur papier Dépôt d’une goutte de 10μL de picrate : Test sur 10 papiers différents : plus ou moins absorbant Dépôt sur chaque face des papiers Résultats : Papier blanc épais Papier carton face 1 Papier carton face 2 Calque Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Test de dépôts sur papier Analyse des résultats : Dépôts de couleur différente selon les papiers Diffusion différente entre deux papiers différents Diffusion différente entre les faces d’un même papier Pénétration plus ou moins lente dans les papiers : immédiatement 30 minutes Contour plus foncé des gouttes : conséquences sur la réaction? Goutte de picrate Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Test de dépôts sur papier Dépôt d’une goutte de 5 μL de créatinine à 800 μM : Choix des papiers où la goutte de picrate a pénétré rapidement Résultats : Limite picrate On observe un liseré orangé : Réaction qui se produit ? Limite créatinine Diffusion des molécules Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Test de dépôts sur papier Analyse des résultats : Molécules de picrate chassées par la goutte de créatinine Présence d’un liseré orange : la réaction « semble » se produire MAIS faux positif ? Différence aisée pour public non averti ? VS picrate picrate + créatinine Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Test de dépôts sur papier Cependant un espoir : le papier n° 7 Papier standard créé par les élèves de Pagora en TP Pénétration du liquide dans le volume Diffusion homogène dans le papier Goutte de picrate : Couleur jaune Couleur homogène Réaction semble se produire MAIS diffusion des molécules de picrate par la créatinine Méthode pour les fixer sur le papier Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

V. Tests de dépôt sur micro billes Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Colonne PD 10 Elimination du tampon par Lavage Saturation de la colonne en picrate microbilles poreuses imbibées de picrate Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Observation au microscope Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Réalisation d’une gamme sur billes 50 mg de mélange bille/picrate+15 μlitres de créatinine à différentes concentrations Changements de couleur peu discernables entre 0 et 600 μMolaires. Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Expériences et résultats complémentaires - La réaction ne marche que sur des billes humides La réaction marche que les billes soient mises au frais ou laissées à l’air ambiant. - La réaction est limitée dans le temps: les billes redeviennent jaune clair après quelques heures Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Combinaison billes papier Sur papier peu diffusif: 50 mg mélange Billes picrate + 15 μlitres de Créatinine Concentration Créatinine (μmolaires) 200 400 600 800 Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Combinaison billes papier Sur papier diffusif: Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Une limite: la fixation des billes Scotch : Peu efficace Colle scolaire : empêche la réaction Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

VI. Test sur gel d’agarose Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Comment empêcher le dessèchement des billes ? Si le billes restent en contact avec l’air Assèchement du picrate et absence de réaction après ajout de créatinine Problème de conservation du test Conclusion: nécessité d’isoler les billes de l’air Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Effectuer la réaction dans un gel d’agarose Puits1 : gel 60μL + picrate en solution 60μL Puits2 : billes (50mg) + gel 60μL Puits3 : mélange homogène billes + gel 60μL Ajout de 30 μL de créatinine après solidification du gel Agarose 0,25% Puits1 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 50μL créatinine Puits2 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 25μL créatinine Stœchiométrie 2/3, picrate 1/3 créatinine

Résultats Agarose 0,5% Puits1 : la réaction a lieu => coloration orangée Puits2 : billes au fond du puits, présence d’une couche de gel en surface => le gel s‘est-il glissé entre les billes? La créatinine ne semble pas pénétrer le gel Puits3 : pas de coloration, la créatinine ne pénètre pas le gel Agarose 0,25% Puits1 : coloration orangée au bout de 15-30min Puits 2 : idem

Réalisation d’une gamme colorimétrique réalisation d’une gamme colorimétrique sur gel d’agarose mélangé à 50μL de picrate en solution Ajout de créatinine de 300 à 1000mM Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Test de conservation Réalisation de la même gamme colorimétrique après 48h de repos du mélange gel+picrate La réaction a lieu mais intensité très faible => différence indiscernable. Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Bilan L’utilisation d’un mélange picrate en solution + gel d’agarose semble être une solution exploitable. Problématique1: déplacer la gamme pour distinguer les couleurs correspondant à différentes concentrations en créatinine ? Problématique2: problème de conservation du test, inexploitable à moyen terme.

VII. Bilan, perspectives et coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Bilan des expériences Réactions sur trois types de support : Support Avantages Inconvénients Papier Peu couteux Facilité d’utilisation Diffusion de picrate lors de l’ajout de la créatinine Micro billes Pseudo réaction en solution Observation de la gamme de couleur Couteux Assèchement des billes si mauvais conditionnement Gel d’agarose Peu cher Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Perspectives du projet A développer : Fixation du picrate sur le papier : Structure du picrate à étudier Réaction dans le gel d’agarose : Conditionnement du gel pour faciliter le test Dans des micro-puits Sur une bandelette Goutte de salive Analyse Gel d’agarose + picrate Gel d’agarose + picrate salive Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Merci de votre attention ! Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

bibliographie An Enzymic Reaction-Rate Assay for Serum Creatinine with a Centrifugal Analyzer, Patrick K. Jaynes, Ronald D. Feld, and George F. Johnson Enzymic Creatinine Assay: A New Colorimetric Method Based on Hydrogen Peroxide Measurement, Piero Fossati, Lorenzo Prencipe, and Giovanni Bert Kinetic Enzymatic Method for Determining Serum Creatinine, Gerald A. Moss, Richard J. L. Bondar, and Diane M. Buzzelli Direct detection of renal function markers using microchip CE with pulsed electrochemical detection, Carlos D. Garcia and Charles S. Henry Method for the microassay of endogenous creatinine in blood and urine of small murid rodents, S. HEWITT Mechanism of Interference with the Jaffé reaction for Creatinine, Martin H. Kroli, Nell A. Roach, Brent Poe, and Ronald J. EIIn Reaction of Alkaline Sodium Picrate with Creatinine: Kinetics and Mechanism of Formation of the Mono-Creatinine Picric Acid Complex John Vasillades Soutenance projet créatinine - 13/05/2011