Explication du protocole:

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1 Explication du protocole:
Recherche de la présence d’un pathogène dans une eau de lavage de pomme de terre par technique de PCR

2 Un échantillon d’eau de lavage a été prélevé, puis ensemencé sur milieu LB (Luria-Bertani).
La suite des manipulations se fera à partir des colonies isolées présentes sur ce milieu.

3 1. Extraction de l’ADN

4 1.3. Mettre la colonie en suspension dans le microtube (P1).
1.1. Placer 50µL d’eau déminéralisée stérile dans un microtube (P1) stérile. 1.2. Prélever une colonie bactérienne à l’aide d’une anse calibré à 1µL. 1.3. Mettre la colonie en suspension dans le microtube (P1). Attention à obtenir une suspension très homogène !

5 1.4. Placer le microtube (P1) 1 minute au bain marie à 100°C.
1.5. Placer le tube dans une centrifugeuse 1.6. Centrifuger le microtube (P1) 5 minutes à 4500 rpm. 1.7. Sortir le tube et transvaser le surnageant contenant l’ADN dans un autre microtube (P2) stérile.

6 2. Preparation du Mix pour la PCR (M)

7 2.1. Dans un microtube stérile introduire :
90 µL d’eau distillée stérile 50 µL de tampon 10X 28 µL de MgCl2 25mM 28 µL de dNTP 0,2µM 4 µL de Taq polymérase 2.2. Congeler le tube si la PCR ne se fait pas dans la journée. 2.3. Au moment de l’utilisation, décongeler si nécessaire puis centrifuger rapidement. ! Le mix est fourni déjà préparé !

8 3. Amplification de l’ADN

9 Mélanger votre préparation par pipetage.
3.1. Dans un microtube (A) pour PCR introduire 10µL de solution d’ADN du microtube (P2). 3.2. Ajouter 20µL de mix pour PCR (M). 3.3. Ajouter 10µL de chacune des amorces metkRPECTO et metkFPECTO ou 16SR et 16SF. Mélanger votre préparation par pipetage. Il est possible d’utiliser les deux couples d’amorces en même temps. Les volumes d’amorces prélevés sont alors de 5µL.

10 3.4. Centrifuger rapidement le microtube (A).
T°C Nb cycles 3.5. Placer le microtube (A) dans le thermocycleur Repérer sa position!

11 Témoins pour l’amplification de l’ADN
3.6. Réaliser deux témoins en répétant les étapes 3.1. à 3.5. en remplaçant la solution d’ADN (P2) par : de l’eau : témoin négatif (T-) une solution ADN de Pectobacterium atrosepticum : témoin positif (T+)

12 40 cycles 3.7. Programmer le thermocycleur : - 72°C 5min
o 94°C, 30s o 58°C, 30s o 72°C, 50s - 72°C 5min - stockage à 4°C 5`, 72 °C Fin 30``, 94 ° Denaturation 40 cycles 5`, 96°C Denaturation 30``, 58°C Hybridation 30``, 72 °C Elongation T°C Nb cycles 3.8. Mettre en route l’amplification.

13 Electrophorèse des fragments d’ADN

14 4.1. Dans trois microtubes stériles (E1, E2, E3), placer 10µL de solution de PCR (A, C-, C+).
4.2. Rajouter 2µL de tampon de charge (X) et agiter.

15 4.3. Sortir le gel d’électrophorèse et ôter sa protection.
4.4. Rincer les puits de dépôts à l’aide d’eau déminéralisée. Inclinez la cassette pour déplacer l'excès de liquide vers le bord puis éponger.

16 ! Une plaque sera utilisée pour 3 groupes
4.5. Déposer dans un puits, 5 µL de la solution à tester E1. 4.6. Déposer dans les deux puits suivants, 5 µL des témoins E2 et E3. 4.7. Déposer dans un troisième puits 5 µL de solution de marqueurs moléculaires (W) ! Une plaque sera utilisée pour 3 groupes (12 puits) !

17 4.8. Faire migrer à 220V pendant une dizaine de minutes.
4.9. Arrêter la migration lorsque les premières bandes de la solution de marqueurs moléculaires arrivent au bout du gel.

18 5. Analyser et interpréter vos resultats