Prix Nobel de Chimie 2008 Découverte et utilisation de la Green Fluorescent Protein Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien

Une petite méduse verdâtre! Plus d’eau que dans une bière! Cellules urticantes Aequorea sp.

Osamu Shimomura Marine Biological Laboratory, Boston Etude de la bioluminescence d’Aequorea

La bioluminescence Emission de lumière par des organismes vivants Chémoluminescence biologique

Une réaction bioluminescente OH OH CO2 Luciférase (protéine) O N N N N O 2 N H N H HO HO H L u c i f é r i n e

Le système luminescent d’Aequorea Shimomura & Johnson, 1960s Aequorine: Photoprotéine Ca2+-dépendante Photo : Protein data bank Head, Inouye, Shimomura. Nature 2000

Utilisation de l’aequorine Brini et al 1999

Cinétique du calcium dans des embryons Figure 19.62 Images of Ca2+ waves in gastrulating zebrafish embryos detected by microinjected f-aequorin (recombinant aequorin reconstituted with the coelenterazine f luminophore (C6779)). The images are pseudocolored to represent Ca2+-dependent luminescent flux in (photons/pixel/second × 10-2) according to the color scales shown at the left of each of the three time-lapse image sequences (a,b,c). Time in seconds is indicated in the lower left-hand corner of each frame. The sequences depict three different spatial wave types that are represented schematically at the end of each sequence. PM indicates the dorsal midline pacemaker; its position in the luminescence images is marked by a red asterisk. The image was contributed by Edwin Gilland, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, and reproduced with permission from Proc Natl Acad Sci U S A 96, 157 (1999).

La découverte de la GFP Osamu Shimomura,1962 “A protein giving solutions ..... exhibiting a very bright, greenish fluorescence in the ultraviolet ... has also been isolated from squeezates.” (Shimomura et al. 1962).

397- 475 nm 504 nm J.Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. R!cker, A. Salih, K. D. Spindler, G. U. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 15905.

Campbell, 2008. Scholarpedia Le chromophore Campbell, 2008. Scholarpedia

GFP: le vert intense Ions calcium

A la fois mine.... et alarme antivol!

Le clonage de la GFP Douglas Prasher, 1992 Woods Hole Oceanographic Institution

La séquence de la GFP

L’expression de la GFP chez Caenorhabditis Martin Chalfie, 1994 Columbia University

Caenorhabditis elegans nématode transparent 1 mm de long, 1031 cellules Prix Nobel de Médecine 2002 Sydney Brenner, John Sulston, Bob Horvitz

Un travail fondateur Science 1994

Formation autocatalytique du chromophore Campbell, 2008. Scholarpedia

Réaliser des protéines de fusion

Les avantages de la GFP comme marqueur cellulaire Non-toxique Absence de cofacteur Stabilité Peu d’interactions avec constituants cellulaires

Des outils pour suivre la progression d’un cancer 3 semaines 5 semaines 9 semaines

Une nouvelle vision des cellules Intervalles de 2 sec - RFP séquence adressage mito Hamamatsu.com

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Pre bleach 15 sec 75 sec 300 sec Fusion GFP-E-cadherin Cliffe et al. 2004

Les mutants colorés Roger Tsien, 1996 University of California

Variants colorés de la GFP Environnement chromophore

Campbell, 2008. Scholarpedia Chromophores mutants Campbell, 2008. Scholarpedia

Des variations de λ d’excitation et d’émission Trugnan et al 2004

De nombreuses applications Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

FRET: la protéine Caméléon

Protéine Caméléon Cellule HELA Hamamatsu.com

Marquages multiples des cellules Tubuline - et Histone - 7 min entre images - rein porc

Une palette d’applications

Les FP chez des organismes non-bioluminescents Acropora

Une structure similaire au nidogen-1 10% d’homologie de séquence mais très gde similarité structurale! Les sites conservés fixent le collagène IV et le Perlecan, des protéines importantes des mbs basales des cellules. GFP Nidogen Hopf et al 2001

Le nidogen-1 Böse et al 2006 Hopf et al 2001 Des souris mutantes présentent des anomalies de développement des membres. Fusion des doigts. Böse et al 2006 Hopf et al 2001

Une méduse devenue princesse Révolution en biologie cellulaire Une richesse inouïe d’applications Des perspectives éblouissantes!

The future is bright!

Chromophores naturels GFP UV UV Campbell, 2008. Scholarpedia