Dyskératose congénitale et biogénèse des RNA H/ACA . Christian Trahan et François Dragon, Centre BioMed, Département des sciences biologiques, UQÀM. La dyskératose congénitale est une pathologie qui se manifeste par de multiples phénotypes

Hyperpigmentation de la peau (89%) Dyskératose congénitale (DC) Pathologie qui affecte les tissus à haut renouvellement diagnostique difficile en raison des désordres variés: Hyperpigmentation de la peau (89%) Dysplasie des ongles (88%) Aplasie de la moelle osseuse (86%) Aplasie de la moelle osseuse (86%) Leucoplasies des muqueuses (78%) Pathologies pulmonaires (20%) classé rare Perte prématurée des cheveux (16%) Tendance à la malignité (10%) Ostéoporose (10%)

Dyskératose congénitale (DC) Autres désordres … épiphora Perte prématurée des dents Petite stature /retard de développement microcéphalie Hypoplasie cérébellaire Nécrose avasculaire des hanches et des épaules Déficiences immunologique Problèmes gastroentérique autres…

Les gènes impliqués ont en commun la biologie des télomères: Dyskératose congénitale (DC) Des mutations génétiques ont été identifiés chez environ la moitié des individus répertoriés au DCR Les gènes impliqués ont en commun la biologie des télomères: Corrélation entre la longueur des télomères et l’apparition des phénotypes. Raccourcissement des télomères transmis à chaque génération. La DC est donc considéré comme un problème de la biologie des télomères.

Forme récessive reliée à l’X; mutations dans dyskérine. Dyskératose congénitale (DC) Forme autosomique dominante; mutations dans le RNA de la télomérase (hTR). Forme récessive reliée à l’X; mutations dans dyskérine. Formes autosomique récessives; mutations dans NHP2 et NOP10. Il existe des formes récessives reliée à l’X qui sont causée par des mutations dans le gène de dyskérine Il existe également des forme autosomiques dominantes causées par des mutation dans le RNA de la télomérase (hTR) Jusqu’à récemment, le diagnostique était basé sur la présence de triade phénotypique et le génotypage.

Télomères et problème de réplication Problème de réplication des extrémités chromosomiques fourche de réplication 3’ 5’ DNA télomérique synthèse du brin avancé 3’ 5’ Synthèse du brin retardé [TTAGGG]n [AATCCC]n 2-30 kpb 50-300 b 3’ 5’ Les chromosomes linéaires eucaryotique se terminent par des séquence répétés, par exemple TTAGGG chez l’humain sur une distance de 2 à 30 kpb, avec une extrémité 3’ simple brin qui mesure entre 50-300…la région sb est repliée à l’intérieur du chromosome et forme une structure de capuchon en association avec des protéines, ce qui empêche les chromosomes de fusionner entre-eux La réplication des extrémités chromosomique est problématique. Le problème est le suivant,..lors de la réplication du DNA, synthèse du brin avancé se fait en une seule étape et produit une extrémité 3’ du brin descendant qui se termine à l’extrémité 5’ du brin parental. La synthèse du brin retardé est initiée avec des amorces de RNA qui sont par la suite dégradés, laissant un trou à l’extrémité 5’ du brin descendant, ce qui provoque l’érosion des télomères. 3’ 5’ Extension et dégradation des amorces [TTAGGG]n [AATCCC]n T-loop D-loop 5’ 3’

Extension des télomères par la télomérase 50-300 b Transcriptase inverse (hTERT) RNA (hTR) 3’ 5’ CAAUCCCAAUC Transcriptase inverse (hTERT) RNA (hTR) 3’ 5’ CAAUCCCAAUC GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAGn Nous possédons tous (dans nos lignées germinales et nos cellules souches) une enzyme ribonucléique, la télomérase, qui est capable d’allonger nos télomères. La télomérase comprend un RNA qui renferme la matrice complémentaire aux extrémités simple brin des télomères, et une transcriptase inverse. Après l’hybridation du RNA de la télomérase aux télomères, la transcriptase inverse procède à l’extension du l’extrémité 3’ sb du chromosome. La particule est ensuite transloquée et le cycle se répète n fois.

ψ Structure secondaire de hTR et mutations causant la DC. snoRNA scaRNA rRNA snRNA ψ La structure secondaire de hTR peut être divisé en 2 domaines Nu domaine pseudonoeud qui renferme la matrice complémentaire aux télomères et un domaine ressemblant aux petits RNA H/ACA. La structure consensus de ce domaine est la suivante….. Les RNA H/ACA peuvent être séparés en 2 familles, les petits RNA nucléolaires qui guident la … Et les petits RNA des corps de cajal qui guident quant à euxla… La différence entre les sno et sca est la présence d’un signal consensus qui dirige les sca dans les corps de cajal au lieux du nucléole. Plusieurs mutation sont impliqués dans la Dc sont identifiées en rouge Il a deja été démontré que les mutations (bleu) influencent l’activité de la télomérase Et que les autres mutations retrouvées dans le domaine H/ACA influencent la stabilité de la télomérase

Modèle de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo. Cytoplasme NAF1 Noyau (1) dyskérine Nucléole, Corps de Cajal CTD polII NOP10 GAR1 NAF1 (3) NHP2 (2) Protéines H/ACA Site de transcription des RNA H/ACA Je vous présente un modèle récent de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo. Tout dabord, les potéines spécifiques aux RNA H/ACA forment un tétramère dans le cytoplasme. Ce tétramère est ensuite recruté au site de transcription de RNA H/ACA via une interaction entre NAF1 et le domaine C-terminal de la polymérase II. Le tétramère s’associe alors avec le transcrit naissant, et par la suite, selon un méchanisme encore inconnu, NAF1 est échangé pour GAR1, ce qui rend les particules actives, lesquelles localiseront ensuite dans le nucléole ou les corps de cajal selon l’identité du RNA.

Élaboration d’un système d’étude in vitro. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Inv 413-416 C408G

 Méthodologie Analyse surnageants SDS-PAGE 4-12% Transcription in vitro (32P-CTP) hTR204 hTR204 mutés U3 RNA CTRL- Purification sur gel IP dyskérine ou NAF1 Transcription/traduction in vitro (35S-méthionine) NAF1 Dyskérine Fibrillarine CTRL- NHP2 NOP10 IP dyskérine ou NAF1 SDS-PAGE 4-12% fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX.  Analyse des RNA sur Molecular Imager FX 35S transparent

Le tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 s’assemble correctement T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP - NAF1 - NHP2 - NOP10 - NAF1, NOP10 - NAF1, NHP2 - dysk. Toutes  IP dyskérine NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 NAF1 Dysk. fibrillarine NHP2 NOP10 dyskérine Afin de m’assurer de l’intégrité des protéines synthétisés dans le lysat de réticulocyte de lapin, j’ai d’abord synthétisé chacune d’elle séparement. Afin de m’assurer que le l’assemblage du tetramere se fait correctement, j’ai ensuite procédé à des IP de dyskérine sur des mixtures ou des protéines sont absentes. Lorsque l’IP est effectué sur la mixture contenant toutes les proteine, l’immunoprécipité contient … L’IP effectuée sur la mixture dans laquelle dysk. Est absente constitue un contrôle negatif, et l’on peut voir un bruit de fond qui est nettement inférieur à celui obtenu avec toutes les protéines Lorsque NAF1 est absente de la mixture protéique, le trimere dkc-NOP10-NHP2 peut etre immunoprecipite Lorsque NHP2 est absente, un trimere NAF-dkc-NOP Lorsque NOP …..Un dimere NAF1-DKC ….

Le tétramère lie spécifiquement le domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer à hTR204. dyskérine NOP10 NHP2

NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer aux RNA H/ACA dyskérine NOP10 NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

Conclusions Nous avons élaboré un système de reconstitution in vitro qui récapitule l’assemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis d’analyser l’effet des mutations dans ce domaine sur l’assemblage de la RNP. Aucun défaut d’assemblage n’est causé par la mutation C450A n’a pu être détecté dans notre système. Nous démontrons pour la première fois que la délétion Δ378-451 ainsi que la mutation ponctuelle C408G abolissent la liaison du tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 au domaine H/ACA de hTR. Nos résultats suggèrent que les mutations C408G et Δ378-451 engendrent des défauts d’assemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC.

Perspectives

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

Conclusions

perspectives

 Méthodologie Analyse surnageants SDS-PAGE 4-12% Transcription in vitro (32P-CTP) hTR204 hTR204 mutés U3 RNA CTRL- Purification sur gel IP dyskérine ou NAF1 Transcription/traduction in vitro (35S-méthionine) NAF1 Dyskérine Fibrillarine CTRL- NHP2 NOP10 IP dyskérine ou NAF1 SDS-PAGE 4-12% fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX.  Analyse des RNA sur Molecular Imager FX 35S transparent

hTR WT hTR-G450A Mature 3’end 3’ genomic sequence TGC AGTTCGCTTTCC… frequency TAC 1/9 4/9 A 2/9 AG AA AGAA AAAA AGAAA AGTTC AGTTCGCT AGTTCGCTT

HeLa BeWo Mature 3’end 3’ genomic sequence frequency TGC AGTTCGCTTTCC… 6/11 9/12 A 2/11 1/12 AG 1/11 AAAAA AGAAAAA AGTA AAAAAA

Conclusions

perspectives

Remerciements François Dragon, Directeur les membres du laboratoire Caroline Martel, assistante de recherche. Yves Henry, CNRS Toulouse. Lapins Néo-Zélandais blanc Chantal Autexier, McGill. Gabriele Varani and Steve Reichow, University of Washington