Le peignage moléculaire de l'ADN génomique Un nouveau test diagnostique de la Dystrophie Facio-Scapulo-Humérale Karine Nguyen, Pierre Walrafen, Charlène Chaix, Catherine Vovan, Rafaelle Bernard, Shahram Attarian, Jean Pouget, Nathalie Dufrane, Anne Vannier, Aaron Bensimon, Nicolas Lévy Département de Génétique Médicale /UMR Inserm U 910 Marseille

FSHD : une maladie génétique complexe 3ème dystrophie musculaire en fréquence (1/10000 à 1/20000) Autosomique dominante à pénétrance incomplète et expressivité variable ~ 1/3 de cas sporadiques: pénétrance incomplète mutations de novo mosaïques somatiques Clinique: déficit des muscles de la face, atteinte sélective et asymétrique

FSHD : une anomalie moléculaire complexe Locus 4q35 normal 11 - >100 répétitions (35 - >300 Kb) FRG1 TUB4Q FRG2 Homologie 10q26 D4Z4 Telomere DUX4C FSHD 1 - 10 répétitions (< 35 Kb) FRG2 TUB4Q FRG1 D4Z4 Telomere DUX4C FRG2 TUB4Q FRG1 4qB D4Z4 Telomere DUX4C normal FRG2 TUB4Q FRG1 4qA D4Z4 Telomere DUX4C FSHD

FSHD : un diagnostic moléculaire complexe Chr. 4 Chr. 10 2 3 E E/B E E/B E E/B PFGE EcoRI p13E11 BlnI Southern blot sur ADN génomique EcoRI

FSHD : un diagnostic moléculaire complexe L'exploration des patients est incomplète Environ 20% de diagnostic ambigu Variants génomiques mal diagnostiqués Mosaiques somatiques fréquentes Translocations entre D4Z4 du chr4 et du chr10 Délétions non canoniques (p13E11) 2 UR E E+B E E+B E E+B Deletion of repeated sequences Close to the telomere (4q)‏ Homology 4q/10q Polymorphism 4qA/4qB vs 10qA

La technologie: le peignage moléculaire de l'ADN Analyse d'une molécule d'ADN génomique unique molécules d'ADN de haut poids moléculaire, individualisées, étirées, fixées, linéaires et parallèles Facteur d'étirement constant, conversion 1µm = 2 kb 100 génomes sur une lame, fibres de 100kb à 2 Mb de long Bensimon et al., Science 1994 2.106 Permet l'analyse de l'ADN génomique à l'échelle d'une molécule unique Le procédé consiste à .. Receeding meniscus Very high MW DNA molecules, Hybridation of DNA probes on combed DNA, detected by fluorescence microscopy Probes from ~500 bp to 150+ kb Résolution d' ~1 kb Direct reading of the physical cartography Deletions Amplifications Insertions Inversions Translocations Virtually unlimited multiplexing

Le peignage moléculaire de l'ADN couplé au Code Barre Génomique 106 Hybridation de sondes fluo spécifiques sur les fibres d'ADN peignées et détection en immunofluorescence visualisation et enregistrement des signaux par un microsope à haute résolution Cartographie physique d'une molécule d'ADN unique sur de grandes régions génomiques à la résolution de 1kb Visualisation directe de la position des sondes permet de faire une cartographie physique de la région Répétitions Distance Longueur Couleur Cartographie physique de grandes régions génomiques à la résolution de 1 kb et à l'échelle d'une molécule d'ADN unique

Cartographie physique du locus FSHD design des sondes chr. 10 chr. 4 4 ≠10 qA ≠ qB D4Z4 4qB 10q(A) 4qA 10 28 5 35 code barre génomique spécifique à chaque pathologie 1 sonde sur le D4Z4 et plusieurs sondes spécifiques du 4 et du 10, de qA et qB, code barre à 3 couleurs Reconnaissance des chromosomes 4 et 10 et mesure physique directe et précise du signal vert D4Z4 sur le chromosome 4 la mesure de la longueur de la sonde D4Z4 est une évaluation précise de la longueur du fragment D4Z4 et donc du nb de répétitions, les autres sondes servant à identifier la localisation du D4Z4 5 7

FSHD : résultats Visualisation directe des 4 allèles chez un patient 4qA (10.4 kb) 4qB (66.3 kb) 10q (99 kb) 1 patient 1 lame 1 manip consistency with Southern blot 10q (152 kb) 10 kb

FSHD : résultats All 4q 10q 4q 4q 10q 10q La technique du peignage moléculaire a une puissance statistique car comptage du nombre de signaux identifiables sur la lame. Ainsi lorsque tous les signaux D4Z4 sont comptabilisés, on peut identifier 4 pics correspondant aux 4 allèles du 4 et du 10 à des tailles différentes. 10q 10

FSHD: mosaïque somatique All 4q 10q 10 kb Foetus Mother E E+B E E+B 2 UR Dans le cas présenté sur cette diapo, on suspectait la présence d'une mosaique chez cet individu à cause de cette bande d'intensité faible, ce qui a pu etre confirmé en peignage par la présence d'un 5 ème pic de faible intensité correspondant à du chromosome 4 11 11

FSHD: mosaïque somatique All 4q Le pic correspond sur la lame à ce signal D4Z4 mesuré à 2UR 10q 10 kb 12 12

Remaniements complexes… FSHD : résultats 50 kb 10 kb 20 kb 10q D4Z4 Remaniements complexes… 13

Le peignage moléculaire de l'ADN Le peignage comme nouveau test diagnostique de la FSHD Visualisation directe et simultanée des 4 allèles en 1 seule manip Détection des mosaïques, des remaniements complexes Test rapide, fiable, sensible et spécifique Supprime les inconvénients liés à la technique du SB Nouvel outil de recherche pour explorer la région