Les liposomes : Structure, propriétés et comportement in vivo 1960: Alec Bangham (Cambridge, UK): liposomes et modèles membranaires 1965: début d’encapsulation de PA dans des liposomes 1965-2008 : 9 000 publications (ScienceDirect) La structure liposomale a été décrite pour la première fois en 1960 par Alec Bangham (Cambridge, UK). Le liposome a tout d'abord été considéré comme modèle membranaire. Dès 1965 se sont développées des recherches sur l'encapsulation de principes actifs, caractérisées par des difficultés technologiques très importantes pour la mise au point de ces formulations. Pendant une trentaine d'années il y a eu de nombreux travaux scientifiques sur les liposomes dans des domaines d'application très variés pour aboutir seulement aujourd'hui à des formes liposomales de principes actifs disposant d'une AMM.

structure et propriétés Les Phospholipides : structure et propriétés Glycérol Acides gras Groupe phosphorylé Tête polaire Partie hydrophobe = molécule amphiphile Les liposomes sont préparés généralement à partir de phospholipides. Pour comprendre les propriétés des liposomes, il est nécessaire de rappeler les caractéristiques des phospholipides : - un squelette glycérol, - une partie hydrophile : tête polaire de nature variable (nature, charge), - une partie hydrophobe : 2 acides gras caractérisés chacun par leur longueur et la présence d’insaturation. Les phospholipides sont donc des molécules amphiphiles.

Les systèmes phospholipides/eau Etat lamellaire (cristal-liquide) Têtes polaires = hydrophiles H2O Matrice hydrophobe Lorsque des phospholipides sont présents avec un excès d’eau et du fait de leur propriété amphiphile, ils s’organisent spontanément en un structure lamellaire définissant une frontière entre deux espaces aqueux. Une telle structure, si elle est soumise à un apport d’énergie, va se vésiculer pour former des liposomes. Organisation spontanée des phospholipides dans l’eau Adapté de J.F. Faucon et P. Meleard, Polymorphisme des lipides. Contraintes stériques et élastiques. Dans « Liposomes » , Edition INSERM - Lavoisier TEC et DOC, 1993, Chap. 1, 7-36.

Notion de température de transition de phase Etat dit gel solide Etat dit gel fluide T° < T°c T° > T°c Cet état lamellaire de la paroi confère aux liposomes une propriété essentielle : notion de température de transition de phase liée à la nature des chaînes des phospholipides et de leur degré d’insaturation. Sous l’influence de la température, l’état lamellaire peut osciller réversiblement entre plusieurs configurations (transitions de phase) : - les chaînes grasses sont parallèles et rigides à une température inférieure à celle de la transition de phase, - les chaînes grasses sont mobiles (état dit «fluide») à une température supérieure à celle de la transition de phase. Ces états sont de première importance dans la mesure où ils conditionnent les capacités d’échange avec le milieu environnant (perméabilité, échange de composés de la paroi). Chaînes rigides et parallèles Chaînes mobiles Adapté de J.F. Faucon et P. Meleard : Polymorphisme des lipides. Contraintes stériques et élastiques. Dans  « Liposomes » , Edition INSERM - Lavoisier TEC et DOC, 1993, Chap. 1, 7-36.

Systèmes médicamenteux particulaires : Les systèmes supramoléculaires organisés Micelle Espace interne aqueux Liposome Bicouche phospholipidique On regroupe parmi les systèmes supra-moléculaires organisées des structures très différentes : les micelles, les émulsions, les dispersions colloïdales. Le liposome fait partie des états organisés de molécules tensioactives et peut être défini comme une vésicule constituée d’une ou plusieurs bicouche(s) de nature phospholipidique entourant un espace interne aqueux. J.M. Devoisselle, La Lettre du Pharmacologue, 1997, 11, 10, 2-7.

Association liposome-principe actif : Importance de la solubilité Molécule lipophile Molécule hydrophile Molécule amphiphile Phase aqueuse interne L’association d’un principe actif avec des liposomes repose essentiellement sur les caractéristiques physico-chimiques de celui-ci : - des principes actifs très hydrosolubles seront localisés dans la phase aqueuse interne des liposomes, - des molécules amphiphiles seront insérées pro-parte dans cette bicouche, - des molécules liposolubles seront enchâssées dans la matrice hydrophobe de la paroi liposomale. J.M. Devoisselle, La Lettre du Pharmacologue, 1997, 11, 10, 2-7.

Avantages liés à l’encapsulation d’un principe actif dans des liposomes Solubilisation de P.A. peu solubles dans l’eau Libération programmée dans le temps Protection du principe actif Diminution de la toxicité du P.A. Ciblage Les avantages des liposomes sont les suivants : - la capacité de solubilisation : c’est le cas de l’amphotéricine B, - la libération retardée : il est possible de formuler la paroi liposomale de telle sorte à maîtriser la cinétique de libération de P. A., - la protection des principes actifs : c’est le cas par exemple de la dégradation enzymatique ou de la transformation chimique, - la diminution de toxicité : un des avantages les mieux documentés en clinique (cas de l’amphotéricine B et des anthracyclines), - le ciblage, c’est-à-dire l’atteinte préférentielle de tissu cible.

Importance de la transition de phase Phénomènes de déstabilisation : stabilité au stockage déstabilisation dans le sang fixation des protéines échange de lipides avec les lipoprotéines libération du P.A. avant la cible La maîtrise de ces états repose sur le choix adéquat des constituants de la paroi liposomale. Ainsi l’optimisation de leur formulation permettra : - une meilleure stabilité au stockage, - la limitation des effets déstabilisants dus aux interactions avec les constituants du sang (protéines, lipoprotéines), - le contrôle de la libération de principe actif (P.A.) au niveau du site où il agit. Importance de la formulation

Perméabilité des liposomes dans le sérum : effet de la longueur de chaînes des phospholipides Marqueur : carboxyfluorescéine - Incubation in vitro à 37°C DSPC (1,2 distearoyl-glycero-3-phosphocholine) : C18,0 ; T°c = 55°C DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholine): C 16,0 ; T°c = 41°C Adapté de J. Senior et G. Gregoriadis, 1982, Life Sciences, 30,2123.

Formulation des liposomes Matières premières : Phospholipides d’origine naturelle Phospholipides hydrogénés Phospholipides et lipides synthétiques Cholestérol Autres agents tensioactifs

Caractérisation des liposomes Chimique : composition ratio principe actif/lipides stabilité chimique des composés Physique : nombres de bicouches (lamellarité) taille stabilité (agrégation, fusion) étude de la structure et des propriétés de la paroi

Cas de la formulation de l’amphotéricine B Relation formulation - toxicité Formule Type Ratio DL50 AmBisome SUV (Adler-Moore, 1993) HEPC/DSPG/ampho B 2:0.8:0.4 < 20 mg/kg HEPC/ Chol/ DSPG/ampho B 2:1:0.8:0.4 > 30 mg/kg HEPC/ Chol/ DSPG/ampho B* 2:1:0.8:0.4 > 35 mg/kg HEPC/ Chol/ DSPG/ampho B** 2:1:0.8:0.4 > 50 mg/kg (*) : ultrasons ; (**) : microfluidisation DSPG: distearoyl-phosphatidylglycerol (charge négative) HEPC: hydrogenated egg phosphatidylcholine Le cas des formulations lipidiques de l’amphotéricine est exemplaire; ce tableau rassemble les études de formulation menées par Jill Adler-Moore pour encapsuler l ’amphotéricine B dans les liposomes (AmBisome®) : - le critère de choix est la DL 50 : un critère de toxicité et non de formulation pharmaceutique stricto-sensu, - la progression de cette étude met en évidence le rôle du DSPG (charge négative) et du cholestérol dans la stabilisation de l’amphotéricine B, - enfin, et ceci est typique de la technologie des formes colloïdales et spécialement des liposomes, l’influence des choix technologiques mis en œuvre qui conditionneront la morphologie (lamellarité) et la répartition granulométrique des liposomes. J. Adler-Moore, RT Profitt., Journal of Liposome Research, 1993, 3, 3, 429-450.

Structure schématique d’AmBisome® Membrane phospholipidique DSPG Cholestérol Molécules d’amphotéricine B

Les formes lipidiques de l’amphotéricine B (1) Critères de distinction : - morphologie et taille - formulation - le rapport amphotéricine B/lipides Cependant, différentes formulations de l’amphotéricine B ont été mises au point et sont caractérisées par un certain nombre de critères : - la morphologie et la taille, - la formulation, - le rapport amphotéricine B/lipides. Ces différences auront pour conséquence d’engendrer des comportements in vivo particuliers.

Les formes lipidiques de l’amphotéricine B (2) L’amphotéricine B a fait l’objet de différentes formulations lipidiques dans le double but de solubilisation et de diminution de sa toxicité : - la forme la plus connue est la Fungizone® (d-AmB) qui, une fois reconstituée permet l’obtention de micelles de sels biliaires incluant de l’amphotéricine B, - Les micelles mixtes de cholesteryl sulfate sont une forme particulière de micelle, - Le complexe lipidique, lui, est une dispersion de mélange phospholipides/amphotéricine B formant un réseau de rubans (état cristal liquide), - Enfin, la forme vésiculaire dite liposomale (AmBisome®). De plus, il est à noter des préparations extemporanées issues d’un mélange émulsion lipidique parentérale/fungizone.

Les formes lipidiques de l’amphotéricine B : exemples de structures < 100 nm Abelcet : 1600 à 6000 nm Amphocil :122 nm Ces différentes formulations répondent à des morphologies très différentes : - « ABCD » se présente sous la forme d’un disque aplati constitué par une lamelle ou bicouche de cholesteryl sulfate, - « ABLC » est en fait un réseau interpénétré de rubans, formé par le complexe phospholipide/amphotéricine B. C’est un exemple original des états physiques des phospholipides, - AmBisome® est un liposome unilamellaire de petite taille. A.M. Hillery, Advanced Drug Delivery Reviews, 1997, 24, 345-363.

Ces différentes formulations répondent à des morphologies très différentes : - « ABCD » se présente sous la forme d’un disque aplati constitué par une lamelle ou bicouche de cholesteryl sulfate, - « ABLC » est en fait un réseau interpénétré de rubans, formé par le complexe phospholipide/amphotéricine B. C’est un exemple original des états physiques des phospholipides, - AmBisome® est un liposome unilamellaire de petite taille.

Ces différentes formulations répondent à des morphologies très différentes : - « ABCD » se présente sous la forme d’un disque aplati constitué par une lamelle ou bicouche de cholesteryl sulfate, - « ABLC » est en fait un réseau interpénétré de rubans, formé par le complexe phospholipide/amphotéricine B. C’est un exemple original des états physiques des phospholipides, - AmBisome® est un liposome unilamellaire de petite taille.

Toxicité des formulations lipidiques de l’amphotéricine B 1. Amphotéricine B et toxicité cellulaire : - l’amphotéricine B forme des pores dans les membranes cellulaires contenant des stérols (mammifères et fungi) - ces pores entraînent une fuite des cations monovalents et autres constituants mort cellulaire - la sensibilité des fungi est x10 comparée aux cellules de mammifères (affinité + grande vers l’ergostérol comparée au cholestérol) Pour comprendre la particularité de l’aspect pharmaceutique des formes lipidiques de l’amphotéricine B, il est nécessaire de considérer non plus la molécule amphotéricine B d’une part et ses excipients d’autre part, mais de considérer le complexe lipides-amphotéricine B comme étant une structure gardant plus ou moins son intégrité après injection dans le torrent circulatoire. L’origine des travaux de formulation repose sur les problèmes de toxicité posés par l’amphotéricine B. La toxicité de l’amphotéricine B est due à ses propriétés auto-associatives et à son affinité pour les membranes.

Toxicité des formulations lipidiques de l’amphotéricine B 2. toxicité in vivo « Elle est fonction de la capacité de l’amphotéricine B à se partager au niveau des membranes cellulaires » dépend de la stabilité énergétique de l’amphotéricine B dans la formulation lipidique dépend de la biopharmacie de la formulation (pharmacocinétique et biodistribution) La toxicité in vivo non plus de l’amphotéricine B seule mais celle de l ’amphotéricine B associée aux lipides repose sur deux aspects fondamentaux : - la capacité de l’amphotéricine B à se libérer des formes lipidiques pour intégrer la membrane cellulaire au niveau rénal, - le comportement des formes lipidiques in vivo au travers des aspects pharmacocinétiques et de biodistribution.

Toxicité des formulations lipidiques de l’amphotéricine B 3. Test de toxicité des globules rouges : fuite K+ - test le plus sensible (concentration et cinétique) et le plus précis - il reflète la toxicité de la formulation en elle-même (= la propension physico-chimique de l’amphotéricine B à interagir avec les membranes), et donc du mécanisme d’action de l’amphotéricine B. Il existe différents tests de toxicité : l’hémolyse, l’inhibition de la pompe Na+/K+, les dommages oxydatifs et enfin le test de fuite potassique. A part la fuite potassique, les autres tests relèvent plus d’effet de second ordre. Le test de fuite potassique présente les caractéristiques suivantes (voir diapositive).

Toxicité des formulations lipidiques de l’amphotéricine B - la formulation la moins toxique est AmBisome Liée à : - une structure liposomale - une grande stabilité des liposomes à 37°C température de transition de phase élevée (~55°C) stabilisation de l’amphotéricine B un ratio lipides/ampho B favorable à la stabilisation En résumé, cette diminution considérable de toxicité comparée aux autres formes lipidiques de l’amphotéricine B est liée à : - la structure liposomale en elle-même, c’est-à-dire, une vésicule dotée d’une paroi phospholipidique organisée en bicouche, organisation semblable à celle de la membrane cellulaire, - une grande stabilité de cette paroi grâce à : température de transition de phase élevée (~55°C), stabilisation de l’amphotéricine B, un ratio lipides/amphotéricine B favorable à la stabilisation.

Cinétique de fuite potassique en fonction de la formulation Pool de sang humain : incubation 12h à 37°C Temps (minutes) [K+] AmBc : 0,01 mg/ml ABCD : 0,1 mg/ml ABLC : 0,1 mg/ml AmBisome : 0,8 mg/ml 0 100 200 300 400 500 40 35 30 25 20 15 10 Les résultats obtenus sur les différentes formes lipidiques de l’amphotéricine B montrent clairement l’effet de la formulation sur la cinétique de la fuite du K+. Ce test se traduit donc par la capacité de l’amphotéricine B à se libérer et à interagir avec les membranes cellulaires. Il ne peut pas être représentatif de ce qui pourrait se passer en présence de membranes de cellules fongiques. Il met bien en évidence des différences importantes suivant la formulation de l’amphotéricine B. G.M. Jensen, C.R. Skenes, T.H. Bunch, C.A. Weissman et coll., Determination of the Relative Toxicity of Amphotericin B Formulations : A Red Blood Cell Potassium Release Assay - Drug Delivery, 6:1-8, 1999

Corrélation fuite K+/concentration en amphotéricine B -4,0 -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 70 60 65 55 50 45 35 40 30 20 25 15 AmBc ABCD ABLC AmBisome [K+] (mM) Log ([amphotéricine B, mg/ml)] Ce même test, mais à des concentrations allant croissantes d’amphotéricine B, met là aussi en évidence l’avantage d’une structure liposomale stable.

Toxicité : corrélation in vitro / in vivo K50 (amphotéricine B mg/ml) 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 20 40 60 80 100 120 140 160 180 AmBc ABLC ABCD L-AmB AmBisome® DL-50 chez la souris (mg/kg) Cette figure représente les données de DL 50 et de K50 (concentration d’amphotéricine B nécessaire pour libérer 50 % de K+ lors de l’essai). Elle met en évidence les effets de formulation. Le test de fuite K+ semble représentatif de la toxicité aiguë in vivo. L-AmB : formes liposomales d’amphotéricine B ayant une composition identique à AmBisome®. Ces différentes formes élaborées au cours du processus de développement ont permis d’obtenir une formulation optimisée, pour enfin aboutir à la spécialité pharmaceutique “ AmBisome® ”. G.M. Jensen, C.R. Skenes, T.H. Bunch, C.A. Weissman et coll., Determination of the Relative Toxicity of Amphotericin B Formulations : A Red Blood Cell Potassium Release Assay - Drug Delivery, 6:1-8, 1999

Comportement des liposomes in vivo : cas de la voie intraveineuse Après injection : interactions avec les constituants du sang protéines lipoprotéines Ces interactions dépendent de : la composition l’état physique (rayon de courbure, fluidité) la charge la présence de défauts structuraux la dose Le comportement des liposomes in vivo après injection intraveineuse doit être abordé pour comprendre ce que peut devenir le principe actif qui lui est associé. C ’est une approche originale dans la mesure où les particules ou colloïdes, et spécialement ceux qui sont associés à l ’amphotéricine B, se retrouvent dans la circulation sanguine. C’est donc en partie leur devenir qui conditionne celui du principe actif. Dès leur introduction dans le sang, les liposomes peuvent interagir avec ce milieu et en particulier avec les protéines et les lipoprotéines. Ces interactions dépendent des caractéristiques physico-chimiques de la suspension. Libération du P.A., voire destruction des liposomes Influence sur la pharmacocinétique et la biodistribution J.M. Devoisselle, La Lettre du Pharmacologue, 1997.

Interactions des liposomes avec les constituants du sang Phospholipides Opsonines La nature des interactions entre liposomes, protéines et lipoprotéines peut se résumer ainsi : 1. Les protéines, dont les opsonines, peuvent s’adsorber à la surface des liposomes et provoquer ainsi l’activation des cellules du système phagocytant mononucléé entraînant leur élimination. 2. Des échanges lipidiques entre liposomes et lipoprotéines susceptibles de modifier la composition de la paroi liposomale et faciliter ainsi encore plus l ’absorption protéique. De façon concomitante le principe actif qui est associé aux liposomes, suivant l’ampleur de la déstabilisation, peut être libéré dans le milieu extérieur. Exemple : amphotéricine B Õ lipoprotéines. HDL J.M. Devoisselle, La Lettre de l’Infectiologue, 1999, tome XIV, n°3, sup.2, 18-20.

Relation stabilité in vitro et élimination plasmatique des liposomes 100 (a) (a) Perméabilité des liposomes dans le plasma (liposomes marqués à la 5,6-CF et incubés dans le plasma de souris) DSPC/Chol 80 60 DSPC 40 (%) 100 (b) DSPC/Chol (b) Perméabilité des liposomes in vivo (liposomes-5,6-CF injectés chez la souris) 50 Du fait de ces interactions avec les constituants du sang, il existe donc une relation étroite entre la stabilité in vitro et le comportement pharmacocinétique. Ainsi, si l’on compare l’effet stabilisant procuré par la présence de cholestérol dans la paroi de liposomes, on peut observer que les liposomes les plus stables in vitro sont les DSPC/cholestérol, ce sont ceux qui présentent les temps de résidence dans le sang les plus grands. Il est ainsi clairement démontré que lors de la formulation des liposomes, la maîtrise de l’interface (surface des liposomes présentée au milieu biologique) est capitale concernant leur devenir in vivo ainsi que celui du principe actif qui lui est associé. 20 DSPC 10 (heures) 0 10 20 30 40 50 J. Senior et G. Gregoriadis, FEBS Letters, 1982, 145, 109.

Elimination sanguine des liposomes : Effet de la température de transition de phase des phospholipides 100 T° transition : DSPC : 55°C DMPC : 23°C PC œuf : 4°C % dose administrée 10 DSPC DMPC PC œuf Un autre exemple en est donné par le choix des phospholipides (donc de la température de transition de phase). Plus la température de transition de phase est élevée, moins le liposome est déstabilisé. Ceci a pour conséquence l’allongement du temps de vie plasmatique des liposomes. A titre comparatif : DMPC T°C : 23 °C é < 37°C DSPC T°C : 55 °C é > 37°C é Stabilité des particules formulées avec DSPC. 1 10 20 30 40 Temps (min.) Adapté de J. Senior et G. Gregoriadis, FEBS Letters, 1982, 145, 109.

Biodistribution des liposomes * situation physiologique : capture par le S.P.M. Foie Rate Poumons Moelle osseuse * cas pathologiques : perte de l’intégrité de la paroi vasculaire (tumeurs solides, sites inflammatoires, infections) Leur capture ainsi activée, les liposomes vont donc se localiser dans les organes possédant des cellules du système phagocytant mononucléé : - le foie (cellule de Kupffer), - la rate, - les poumons, - la moelle. Naturellement, ils n’ont aucune capacité à sortir de la circulation sanguine sauf dans des cas pathologiques conduisant à une perte locale de l’intégrité vasculaire et/ou une activation cellulaire locale de type phagocytose.

Relation entre diamètre des liposomes et comportement in vivo Endothélium à structure continue Endothélium à structure fenestrée Endothélium à structure discontinue (sinusoïde) Cellules endothéliales Membrane basale Cellule de Kupffer 100 nm hépatocytes Si l’on considère d’un point de vue histologique la capacité des liposomes à franchir des barrières vasculaires, on observe par exemple au niveau du foie des capillaires sinusoïdes dont l’ouverture est de 100 nm. Ceci entraîne deux remarques : 1) Les mécanismes de capture : - une capture des liposomes par les cellules de Kupffer débordant dans la circulation, - un franchissement de l’ouverture, la pénétration dans l’espace de Disse et enfin la capture par les hépatocytes. 2) L’importance de la granulométrie : - la pharmacocinétique sera différente pour des liposomes de grande et de petite taille. Adapté de G. Poste, Drug targeting in cancer therapy in receptor mediated targeting of drugs (G. Gregoriadis, G. Poste, J. Senior, A. Ttrouwt Eds., Plenum Press, NY and London, 1984)

Mécanismes de pénétration des liposomes et de libération du P.A. dans les tumeurs solides Capture par endocytose Cellule endothéliale Liposome chargé en P.A. Cellule tumorale Tissu interstitiel Sortie du lit vasculaire Libération progressive du P.A. J.M. Devoisselle, Kaposi News

Aspects pharmacocinétiques L’élimination des liposomes de la circulation sanguine repose donc sur : la capture liée à la possibilité de sortie du lit sanguin la distribution granulométrique des liposomes la capture cellulaire = processus actif Pharmacocinétique particulière la pharmacocinétique du PA est étroitement liée à celle des liposomes (tenir compte de la stabilité) Liposomes = forme pharmaceutique particulaire

Effet de la taille sur l’élimination sanguine de liposomes après administration i.v. 100 MLV (500 nm) SUV (50 nm) REV (400 nm) 10 Dose administrée (%) Définitions : SUV(Small Unilamellar Vesicle) : petite vésicule unilamellaire. REV(Reverse phase Evaporation Vesicle) : vésicule unilamellaire obtenue par évaporation en phase inverse. MLV(Multilamellar Vesicle) : vésicule multilamellaire. 1 10 20 30 Temps (minutes) Adapté de RL Juliano et D. Stamp, Biochemical Biophysicla Research Communication, 1975, 63,3, 651-659. Et de Senior J., CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1986, 3,2, 123-193.

Aspects pharmacocinétiques La pharmacocinétique des liposomes dépend de : la dose la composition cholestérol lipides polymères de surface ligands (ciblage) l’état physique de la paroi liposomale la répartition granulométrique la charge de surface

Conclusion * Notion de complexe liposome-principe actif * Perspectives : sur le plan fondamental : nouvelles formulations développement des stratégies de ciblage sur le plan médical : infections (bactérie, virus) vaccination (voie d’administration) thérapie génique

TOP TEN Solubilité et pH Préparations extempo. et de Novo des émulsions Potentiel zêta et stabilité Emulsions lipidiques injectables et ac.gras Limethason-like Diazemuls vs. Valium-like Oxygent Microemulsions : Sandimmun vs. Neoral like Diagramme ternaire Comparaison formulations lipidiques Ambisome-like