www.espace-etudiant.net Anton VAN LEEUWENHOEK (1632-1723), drapier hollandais et grand amateur de loupes et instruments d'optique, découvre et décrit entre 1674 et 1687 le monde microbien (« les animalcules »). Mais celui-ci n'est véritablement reconnu qu'à partir du milieu du XIXe  siècle à la suite des travaux de Louis PASTEUR et de ses élèves.

En 1878, SEDILLOT crée le terme de microbes parmi lesquels on distinguera ensuite les bactéries proprement dites et les virus. Le terme virus, qui au début désignait tout agent infectieux, est maintenant réservé à la catégorie bien particulière de microbes qui ne possèdent qu'un seul type d'acide nucléique et qui sont incapables d'assurer à eux-seuls la synthèse de leurs propres constituants. Seule l'expression « réservoir de virus » a gardé un sens général : elle signifie réservoir de germes (de microbes) sans préjuger de la nature exacte du germe (du microbe) en question.

Un prototrophe est un organisme vivant capable de proliférer dans un milieu de base (milieu minimum) sans nécessiter la présence de facteurs de croissance particuliers. Il synthétise lui même les substances nécessaires à sa prolifération. On parle à l'inverse d'auxotrophe

Un plasmide désigne en microbiologie ou en biologie moléculaire une molécule d'ADN surnuméraire distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de cellule. Un épisome est un plasmide qui peut s'intégrer dans l'ADN chromosomique de la cellule-hôte

Les plasmides de résistance Les plasmides de résistance, appelés aussi plasmides ou facteurs R, codent des résistances aux antibiotiques et aux métaux lourds. Les plasmides métaboliques Les plasmides métaboliques portent des gènes permettant l'utilisation de certains nutriments. Chez E. coli, les gènes portés par ces plasmides sont par exemple : l'utilisation du citrate comme source de carbone

Les plasmides de virulence Les plasmides de virulence portent des gènes codant des facteurs de virulence, ayant un rôle dans le pouvoir pathogène des bactéries. Certains plasmides codent des facteurs tumorigènes ; c'est notamment les cas pour la « galle du collet » due à un plasmide Ti (pour tumor inducing) hébergé par les bactéries du genre Agrobacterium. Les plasmides de bactériocines Ces plasmides codent la synthèse d'une protéine extracellulaire dont la biosynthèse est létale pour la bactérie productrice ainsi que pour les autres bactéries non-productrices environnantes. Cependant, ces plasmides codent aussi une deuxième protéine intracellulaire de résistance à cette première toxine. Les bactériocines agissent sur des fonctions vitales de la bactérie.

Comment apparaissent les mutations? (A) Adaptation physiologique : les résistances apparaissent au contact avec les phages (B) Changements génétiques aléatoires : les résistances préexistent par mutations spontanées, le contact avec les phages permet de les révéler GEF L2S4 2008-2009

Hypothèses (A) Adaptation physiologique : les résistances apparaissent au contact avec les phages (B) Changements génétiques aléatoires : les résistances préexistent par mutations spontanées, le contact avec les phages permet de les révéler GEF L2S4 2008-2009

Test de fluctuation de Luria et Delbrück (1943) Phage T1 sur E.coli GEF L2S4 2008-2009

Expérience de E. & J. Lederberg (1952)

conclusions Les mutations se font sans qu’il y ait contact avec les phages DONC : mutations apparaissent spontanément Les phages servent juste à les révéler GEF L2S4 2008-2009

plasmides conjugatifs culture1 culture2 mutations = hasard brassage génétique par transformation par transduction par conjugaison batéries compétentes Batériophages plasmides conjugatifs

Caractères des mutations Spontanées Rares (10-8 - 10-9 mutant/génération) Discontinues (caractère brusque) Stables : transmises à la descendance Indépendantes et spécifiques (ne concerne qu’un caractère) GEF L2S4 2008-2009

La génétique des bactéries et virus Objectifs: Connaître les 3 méthodes d'introduire un fragment d’ADN dans une bactérie E.coli et occasionner ainsi des appariements de fragments de gènes homologues et l’échange d’une copie d’un gène par une deuxième Connaître comment déduire l'ordre des gènes à l'aide de ces méthodes qui impliquent des évènements de recombinaison Non seulement l’ordre des gènes peut-on deduire mais on peut aussi établir une carte exacte!

Génotypes bactériens

Nous avons vu comment les mutations peuvent introduire des variations au niveau des gènes des bactéries. Qu’en est-il de la recombinaison? Procaryotes: pas d'enveloppe nucléaire mais un chromosome circulaire dans le cytoplasme (Monoploide). A l’opposé des eucaryotes, pas de méiose! Alors qu’est ce qui peut occasionner des appariements de gènes homologues

Il y a 3 façons d'introduire un fragment d’ADN ou une deuxième copie d'un gène dans une bactérie. Ceci peut occasionner des appariements de gènes homologues et des recombinaisons qui conduiraient à l’échange d’une copie d’un gène par une deuxième. Conjugaison bactérienne grâce au facteur de fertilité 2. Transformation bactérienne 3. Les virus bactériens ou bactériophages Ordre des gènes peut être determiné et une cartographie du chromosome bactérien peut être effectuée grâce aux résultats de recombinaison.

1) Conjugaison Principe: transfert par l’intermédiaire d’un facteur de fertilité Souches bactériennes : F- = n'ayant pas de facteur F F+ = ayant un facteur F dans le cytoplasme Hfr = ayant un facteur F dans le chromosome F' = ayant un facteur F, contenant un ou des gènes bactériens, dans le cytoplasme 2) Transformation Principe: transfert par diffusion d’ADN dans une cellule bactérienne 3) Transduction Principe: transfert par l’intermédiaire d’un bactériophage Types: restreinte et généralisée

La conjugaison Un épisome (le facteur F) présent dans une cellule bactérienne peut transférer le chromosome de cette cellule dans une autre pendant un contact entre ces cellules Processus par lequel une cellule bactérienne transfère de l'ADN à une autre Dépend de la présence du facteur de fertilité: le facteur F

Propriétés de F Facteur F: Est un "mini-chromosome" d'ADN circulaire (environ 100 kb) qui posséde 4 propriétés principales.

1 - Produit des pili Permettent l'attachement à d'autres cellules bactériennes (tubes d'attachement) Permet le transfert de son ADN à d'autres cellules bactériennes

2 - Le facteur F est un ADN circulaire avec 3 domaines fonctionnels: origine, région d'appariement et gènes de fertilité. Le facteur F peut répliquer son ADN indépendemment du chromosome de la bactérie: ce qui permet son transfert et maintien dans une population de bactéries

3 – Le facteur F peut s’integrer dans le chromosome des bactéries par Recombinaison: aussi appelé épisome. Une partie des bactéries auront F intégré dans leurs chromosomes: Lignées Hfr (haute fréquence de recombinaison).

4- Chaque cellule de ces lignées Hfr va transférer des gènes chromosomiques (d’E. coli, en bleu) durant le transfert de F Le transfert se fait: tête puis chromosome bactérien puis queue

Recombinaison et échange allélique Après l'introduction dans une cellule bactérienne d'un allèle provenant d'une autre cellule, il doit y avoir recombinaison pour intégrer cet ADN étranger. Plus il y aura d’homologies, plus il y aura de chance pour la recombinaison. C’est ainsi que les souches Hfr occasionnent une haute fréquence de recombinaison. Chromosome recombinant + Ce fragment linéaire est perdu parce qu'il n'a pas d'origine de réplication

On obtient à ce stade un mérozygote qui est un diploïde partiel

Les différentes modalités de croisement sont les suivantes : . Les croisements F- X F- sont impossibles (les deux bactéries sont dépourvues de facteur F). . Les croisements F+ X F+ sont impossibles (exclusion de surface). . Lors d'un croisement F+ X F-, le facteur F est transmis à haute fréquence, la bactérie réceptrice devient F+, mais aucun gène chromosomique n'est transmis. . Les croisements Hfr X Hfr sont impossibles (exclusion de surface).

Dans l'exemple proposé, la souche receveuse pourra, par recombinaison être : AB'C' ou A'BC' ou A'B'C ou ABC' ou A'BC ou AB'C ou ABC. Une question de liaisons, de fréquence de crossing-over.

Transfert entre souches A et B Preuve de transfert souche A = met-, bio-, thr+, leu+, thi+ souche B = met+, bio+, thr-, leu-, thi- 1) souche A sur milieu minimal = pas de colonies 2) souche B sur milieu minimal = pas de colonies 3) souches A et B sur milieu minimal = colonies Les souches A et B sont capables de se complémenter

Cette complémentation n'est pas le résultat de transfert de substances nutritives Il doit y avoir contact physique entre les deux souches pour produire des recombinants prototrophes

Conjugaison interrompue À l'aide d'un mélangeur (blender)! Croisement: Hfr: strs a+ b+ c+ d+ X F- : strr a- b- c- d- Conjugaison interrompue à toutes les 5 minutes « Pas de croissance » des Hfr avec streptomycine Les Hfr ont les 4 gènes fonctionnels et on veut voir lesquels de ces gènes la bactérie F- a reçu; on veut donc empêcher les Hfr de croître. NB. a+ (azir), b+ (tonr), c+ (lac+) et d+ (gal+)

Analyse des gènes transférés à F- : Croissance sur des plaques de pétri contenant différentes substances biochimiques pour déterminer le génotype. Par exemple, pour croître sur un milieu ayant lactose comme seule source de carbone, la bactérie F- doit avoir reçu le gène lac+ de la bactérie Hfr

Transfert du gène a+ (azir) commence à 8 minutes, b+ (tonr) à 10 minutes, c+ (lac+) à 17 minutes et d+ (gal+) à 25 minutes

Plus la conjugaison dure longtemps, plus l’ADN bactérien est transféré Environ 100 minutes sont nécessaires pour transférer tout le chromosome bactérien

Carte chromosomique de liaison établie à partir d'expériences de conjugaison interrompue Basé sur le temps de transfert à partir d’une origine Plus un gène est loin de l’origine d’initiation du transfert, plus le plateau de transfert est bas (p. ex., seulement 80 % des conjugaisons durent au moins 10 minutes) Environ 100 minutes sont nécessaires pour transférer tout le chromosome bactérien

Comment le facteur F s’intègre t-il dans le chromosome bactérien? Un seul phénomène de crossing-over va insérer le facteur F à un site d'appariement spécifique. F contient de l'ADN homologue à différentes régions du chromosome d'E.coli, il peut donc s'intégrer à plusieurs endroits. Ceci déterminera par la suite l’ordre dans lequel les gènes seront transférés.

Transfert séquentiel des gènes lors d'un croisement bactérien Différents exoconjugants peuvent transférer des gènes dans un ordre différent Par contre, l'ordre des gènes n'est pas aléatoire. Même espèce = même ordre des gènes! Transfert séquentiel des gènes lors d'un croisement bactérien

Le facteur F peut se répliquer librement dans le cytoplasme ou s'intégrer dans le chromosome d'une bactérie et se répliquer avec lui. F s'intègre à l'aide d'un enjambement unique entre sa région d'appariement et les régions homologues du chromosome d'E. Coli -> bactérie Hfr À l'état intégré, le facteur F est le dernier à être transmis durant la conjugaison. Au début, il ne transmet que son origine et il doit transmettre tout le chromosome bactérien avant de transférer ses gènes de fertilité.

Facteur F’ et sexduction F' est un facteur F qui contient une partie du chromosome d'E. coli. Ceci est souvent le résultat d'une excision imparfaite d'un facteur F intégré dans le chromosome (d'une souche Hfr). Méroploïdie : une cellule bactérienne diploïde pour un locus sur facteur F’ Sexduction = transmission de marqueurs chromosomiques bactériens par un facteur F’

Problème Six souches Hfr d'E. coli transfèrent leurs 5 premiers gènes dans l'ordre suivant: 1) AR - T - RE - K - V 2) V - K - RE- T - AR 3) K - V - O - Y -A 4) AR - ST - R - E -G 5) G - A -Y - O -V 6) A - G - E - R –ST A) Quel est l'ordre de ces gènes sur le chromosome d'E. Coli? B) Quelles sont la position et l'orientation du facteur F de chacune de ces six souches? Dessinez vos réponses sur un dessin du chromosome d'E. coli.

La carte génétique d’E. coli (1963) La carte plus récente est maintenant divisée en 100 minutes

Résumé

Recombinaison et échange allélique Après le transfert par le facteur F, il faut qu'il y ait recombinaison (2 enjambements) pour qu'un recombinant stable soit produit

Procaryotyes – 1 enjambement OR Réplication OR OR OR Pas viable - Il manque des gènes à gauche de l’origine de réplication

Procaryotyes – 2 enjambements OR OR a- a+ a+ a- Réplication (Division de la Cellule) Perdu OR OR a+ a+ Viable Viable

Cartes de liaison avec gradients de transfert Croisement Hfr strs met+ arg+ aro+ his+ X F- strr met- arg- aro- his- Sélection des recombinants sur milieu minimal sans met pour sélectionner pour met+, mais avec arg, aro, his et streptomycine = sélection pour F- recombinantes sans avoir les Hfr initiales. Résultats: met+ = 100% arg+ = 60% aro+ = 20% his+ = 4%

La fréquence à laquelle les marqueurs du Hfr sont retrouvés dans les recombinants correspond à l'ordre dans lequel ils sont transmis - découle de la probabilité décroissante qu'une cellule réceptrice reçoive des marqueurs de plus en plus tardifs 4% 20% 60% 100% His+ Aro+ Arg+ Met+ Plus un marqueur est près de l'origine de transfert, plus il a de la chance d'être transmis

Sélection du premier gène His+ Aro+ Arg+ Met+ His- Aro- Arg- Met- Sélection pour Met+ Plus un gène est près de l’origine, plus il aura de chance d’être transmis Donne de bonnes cartes relatives (ordre) mais pas absolues (% de recombinaison)

Cartographie par sélection du dernier gène His+ Aro+ Arg+ Met+ His- Aro- Arg- Met- Sélection pour His+ Chaque cellule acceptrice (F-) va avoir reçu un brin d’ADN comprenant les 4 mêmes gènes Permet d’établir de cartes exactes (% de recombinaison)

Cartographie de grande résolution En sélectionnant pour le dernier gène à pénétrer dans la cellule F- Aro+ Arg+ Met+ Aro- Arg- Met- Si 10 % des F- deviennent Aro+ Arg- Met- et 4 % des F- deviennent Aro+ Arg+ Met- Alors la distance entre Aro et Arg est 10 unités de cartes et celle entre Arg et Met est de 4 unités de carte (10 et 4 % de recombinaison)

4 possibilités avec 3 gènes