CYTOMETRIE Chapitre I- principe du montage et ce que l’on peut obtenir… I- Montage 1- Fluidique 2- Optique 3- Electronique II. Données obtenues en cytométrie en flux.

Cytométrie de flux, FACS Trieur cellulaire Historique Cytométrie de flux, FACS Trieur cellulaire Quelques idées préconçues: - La cytométrie de flux permet d’analyser des cellules. ….toute particule absorbant et diffusant (y compris la poussière  peut-être détectée par un cytomètre de flux. FACS = Fluorescence Activated Cell Sorting est synonyme de cytométrie de flux. ….Marque déposée par Becton-Dickinson Immunocytometry Systems.

I- Montage = Combinaison d’une partie 1- Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules, 2- Optique: Une source d’excitation et de récupération des signaux, 3- Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur.

Principe d’un cytomètre en flux (fig. 1)

(légende de fig. 1) Laser: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation lumière - monochromatique émise à des longueurs d'ondes discontinues - focalisée avec un faible diamètre (de l'ordre 50µ) - stable au cours du temps Les cellules en suspension dans l'échantillon sont acheminées dans la chambre d'écoulement (1) par une pression de gaz (air ou azote) où arrive aussi un liquide d'entraînement. Elles sortent de la chambre d'écoulement par une buse. =focalisation hydrodynamique (alignement des cellules les unes derrière les autres. Les buses ont des tailles variables selon la taille des cellules à analyser. Les cellules passent ensuite une à une devant la source d'excitation lumineuse (laser (2) ou lampe à vapeur de mercure). Elles émettent alors différents types de signaux lumineux. Pour chaque cellule plusieurs paramètres correspondant aux différents signaux lumineux sont enregistrés simultanément : diffusion de la lumière FSC, SSC et fluorescence FL1, FL2, FL3 FSC : Forward Scatter = Forward Angle Light Scatter = FALS = Diffusion frontale de la lumière Lumière diffusée dans la direction du rayonnement lumineux par une cellule passant devant une source d'excitation (laser, lampe à vapeur de mercure...). Paramètre qui n'est pas une mesure de la taille mais dont l'intensité varie avec la taille des cellules pour un type cellulaire donné. SSC : Side Scatter = Right Angle Light Scatter = RALS = diffusion latérale de la lumière Lumière diffusée à angle droit par une cellule passant devant une source d'excitation lumineuse. Paramètre dont la valeur change avec le contenu cellulaire ("la granulosité") et l'état des membranes.

FlowCell Réservoirs liquides Prise d’échantillon

1- Partie Fluidique: Principe du centrage hydrodynamique

Fonction facultative de triage des cellulaire Principe du tri cellulaire= séparation physique de cellules ou de particules d'intérêt à partir d'une population hétérogène. 1/ Cellules l'échantillon aspirées et injectées une à une par une buse dans un courant continu de tampon. 2/ Interaction cellule avec faisceau laser→ lumière déviée + fluorescence émise 3/ onde de vibration appliquée au jet → gouttes à un point précis (= « break of point ») caractérisé par position +temps d'apparition 4/ traitement de l’information par le programme de tri → décider selon vos critères si la cellule doit être isolée Si une cellule d'intérêt devant être triée a été détectée, le cytomètre attend qu'elle arrive jusqu'au « break of point »pour charger la goutte « drop delay »= distance ( interception du laser avec la cellule et « break of point ») 5/ déflection électrostatique de gouttes chargées (comme dans les imprimantes à jet d'encre) Ex. du FACsAria ® : différent niveau de charge à gauche et à droite → tri simultané de 4 populations

2- Partie optique: Exemple de trajet optique dans un cytomètre en flux.

FSC Detecteur Détecteur SSC Laser ou lampes (à vapeur de Hg ou au Xe) -Signaux obtenus en cytométrie en flux: PARAMETRE SIGNIFICATION UTILISATION Diffusion de la lumière aux petits angles Proportionnelle au diamètre cellulaire Identification morphologique des cellules Diffusion de la lumière à angle droit Proportionnelle au contenu cellulaire Fluorescences Proportionnelles à l’intensité de marquage Marqueurs cellulaires, ADN, ARN, fonctions cellulaires... FSC Detecteur Détecteur SSC Laser ou lampes (à vapeur de Hg ou au Xe)

Diffusion de la lumiere :FSC et SSC Faisceau laser diffusé dans toutes les directions http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html http://www.ifr66.u-bordeaux2.fr/pages/cytomtetrieplateforme.html

Amplitude de la diffusion proportionnel à taille particule

Dépend des appareillages

FSC http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html http://www.ifr66.u-bordeaux2.fr/pages/cytomtetrieplateforme.html

SSC

FSC et SSC

Où sont les monocytes les neutrophiles et les lymphocytes? Exemple d’utilisation de FSC diffusion aux petits angles SSC diffusion aux grands angles pour distinguer les diverses sous populations sanguines Où sont les monocytes les neutrophiles et les lymphocytes?

exemple d’utilisation de FSC diffusion aux petits angles SSC diffusion aux grands angles pour distinguer les diverses sous populations sanguines

-Principales sources d’excitation

-collection de la lumière émise par fluorescence : Différents filtres

(suite légende de fig. 1) Les paramètres sont enregistrés sur des détecteurs (3), qui permettent une mesure qualitative et quantitative du signal. Devant les détecteurs sont disposés des filtres optiques (4) qui assurent la spécificité de la mesure (sélection de l'émission lumineuse en provenance de l'échantillon excité par le laser). Filtre "Long-Pass" (LP) ou "Passe-Haut", laisse passer la fluorescence au dessus d'une valeur: exemple 610 nm pour un LP610 Filtre "Short-Pass" (SP) ou Passe-bas, laisse passer la fluorescence en dessous d'une valeur : exemple 560 nm pour un SP Longueur d'onde en nm Longueur d'onde en nm Filtre "Band-Pass" (BP) ou "Passe-Bande" , laisse passer la fluorescence sur une largeur définie autour d'une valeur centrale : exemple BP 575/26 laisse passer une bande passante de 26 nm centrée sur 575 nm (bande passante 562-588nm) à 50% de transmission. Longueur d'onde en nm Le signal lumineux est transformé en un signal électrique analogique. Ensuite le signal analogique est converti en un signal numérique. Ce signal est enregistré pour chaque cellule pour chaque paramètre constituant ainsi un fichier informatique. Ce fichier est ensuite enregistré et les résultats sont présentés sous forme d‘histogramme

Caractéristiques des principaux fluorochromes utilisés en cytométrie

« Fuites de fluorescence » …Cela sera détaillé dans le chapitre II

3- Electronique: Principe de fonctionnement d’un convertisseur analogique digital (ADC).

Principe d’obtention d’un histogramme monoparamétrique

II. Données obtenues La taille des particules biologiques ("cellules") pouvant être analysées varie selon les cytomètres La nature des particules biologiques analysables est très diverse : bactéries, noyaux, chromosomes, mitochondries ou autres fractions cellulaires, cellules immunitaires, spermatozoïdes, cellules de la spermatogenèse, parasites...                                              Histogramme monoparamétrique: Les résultats des mesures pour chaque cellule sont enregistrés et classés selon un histogramme de fréquence. Nombre de cellules par classe en fonction de l'intensité du signal.

Quelle intensité de fluorescence de chaque population? Exemples ( en tri cellulaire) :                                                                                                                        Quelle intensité de fluorescence de chaque population?

F1 F2 Quelle intensité de fluorescence de chaque population? Histogramme biparamétrique: "dot-plot" = association de deux paramètres : - deux diffusion de la lumière : FS - SSC - deux fluorescences, par exemple: FL1-FL2 - une fluorescence et une diffusion de la lumière, par exemple : SSC-FL1.                                            F1 F2 Quelle intensité de fluorescence de chaque population? Quelle sont les caractéristiques des populations 1, 2, 3, et 4?

Histogramme tridimensionnel: (contour plot, contour/3D) Il s'agit d'un histogramme biparamétrique dont la troisième dimension représente le nombre de cellules.Il permet d'avoir une idée de la proportion des différentes catégories de cellules les unes par rapport aux autres.