Z. Mohammedi. Procéder aux méthodes d’isolement La première étape dans l’isolement et purification d’un constituant cellulaire (membrane, protéine, …..etc)

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1 Z. Mohammedi

2 Procéder aux méthodes d’isolement La première étape dans l’isolement et purification d’un constituant cellulaire (membrane, protéine, …..etc) est de détruire les structures tissulaires et de rompre les cellules d’une manière contrôlée.

3 1. Méthode de rupture tissulaire et cellulaire pour effectuer un isolement, il faut détruire l’organisation tissulaire et cellulaire du matériel biologique: Organe, fragment tissulaire, suspension cellulaire Broyer / Lyser Broyer / Lyser Application des actions de type Mécanique / Physique et ou Chimique / Biochimique Foie Cerveau Culture cellulaire Homogénat: Suspension de constituants cellulaires

4 Les principales Méthodes  Broyage  La Pression  Les Billes de verre  La Sonication  Les Enzymes Lytiques  Les détergents  Choc osmotique

5 Le Choc osmotique Consiste à lyser les cellules fragiles dans une solution hypo-osmotique, qui provoque en premier la turgescence, puis rupture des membranes plasmiques + H2O

6 Le Broyage mécanique Consiste à faire broyer (ou homogénéiser) le matériel biologique, une suspension de cellules par exemple, dans un appareil muni d’un piston, appelé homogénéisateur.

7 Exemples d’ homogénéisateurs

8 La Pression Consiste à exercer une pression sur les cellules, de sorte à faire obliger la suspension cellulaire à passer un travers des ouvertures ou pores, de dimension inférieur au diamètre des cellules, ce qui entraine leur destruction par rupture de leurs membranes

9 Exemple de presses

10 Les Billes de verre Consiste à détruire les cellules par l’action abrasive des billes en verre. Ce type de broyage dégagent beaucoup de chaleur. Il est donc nécessaire de travailler à froid (dans un bain de glace)

11 Exemple de broyeurs à billes

12 La Sonication (Ultrason) Consiste à détruire les cellules par l’emploi d’un Sonicateur, qui engendre des ondes de pression Ultrasonique. Le Sonicateur génère beaucoup de chaleur. Il est donc important de travailler à froid.

13 La sonication: Principe vibration violente, Éclatement des cellules Formation de bulles par "cavitation », Écrasement des cavitations,

14 Exemple de Sonicateurs

15 Les Enzymes lytiques L’utilisation des enzymes lytiques, n’est pas une méthode en elle-même, mais elle représente une étape préliminaire, très efficace pour se débarrasser des matrices extracellulaires ou des parois cellulaires. Ex1: la trypsine et collagénase pour récolter les hépatocytes. Ex2: la cellulase pour détruire la paroi végétale

16 Les détergents Consistent à déstabiliser les membranes, solubilisent les protéines membranaires et forment des amas de lipides dans un solvant aqueux.

17 Exemple de détergents détergent type SDS (sodium dodecylsulfate) Sodium Deoxycholate anionique Nonidet P-40 (octylphenoxypol yethoxyethanol) Rupture des interaction protéines- protéines Solubilisation des protéines Rupture des interaction protéines- protéines Solubilisation des protéines anionique Destruction de la membrane Dénature les protéines Destruction de la membrane Dénature les protéines Non ionique Tensioactif doux, qui n'a pas la résistance à émulsifier les membranes nucléaires. - utile pour détruire les membranes cytoplasmiques des cellules de cultures. - il peut être utilisé pour la récolte des protéines cytoplasmiques. Tensioactif doux, qui n'a pas la résistance à émulsifier les membranes nucléaires. - utile pour détruire les membranes cytoplasmiques des cellules de cultures. - il peut être utilisé pour la récolte des protéines cytoplasmiques. caractéristiques

18 2. Méthode de fractionnement La centrifugation Séparation des organites et constituants cellulaires Force centrifuge Homogénat Surnageant Culot (Sédiment)

19 Centrifugation différentielle Centrifugation en gradient de densité -Dépend de la taille et le poids des particules cellulaires - Utilise des forces de centrifugation différentes et croissantes (des centrifugations consécutives) -Utilise des solutions, qui créent des gradient de densité - Permet l’obtention de plusieurs bandes de séparation (chaque bande est occupée par un constituant cellulaire) Centrifugation

20 Centrifugation différentielle Surnageant 1 Surnageant 2 Surnageant 3 Noyaux Mitochondries Lysosomes Peroxysomes Culot Surnageant 4 MicrosomesRibosomes Cytosol

21 Centrifugation en gradient de densité Centrifugation Récupération des fractions Gradient de saccharose – dense + dense