Protéines cellulaires

Présentation au sujet: "Protéines cellulaires"— Transcription de la présentation:

1 Protéines cellulaires
Méthodes d’étude des   Protéines cellulaires

2 La séparation des protéines par chromatographie:

3 Chromatographie par filtration sur gel (séparation selon la taille):
les colonnes dans ce cas sont remplies de minuscules billes poreuses :  les molécules suffisamment petites pour pénétrer dans les pores traînent à l'intérieur des billes successives au cours de leur déplacement,  alors que les molécules plus volumineuses restent dans la solution circulant entre les billes et migrent donc plus rapidement, sortant les premières de la colonne.  La chromatographie par filtration sur gel ne constitue pas seulement un moyen de séparer les molécules, c'est aussi une façon commode de déterminer leur taille. Taille des pores variable séparation de 500 à 5 x 106Da On dispose dans le commerce de billes de polysaccharide réticulé (dextrane ou agarose) avec un grand choix de tailles de pores, ce qui permet de les employer pour le fractionnement de molécules de masses moléculaires variables, allant de moins de 500 à plus de 5 x 106

4 Chromatographie par échange d’ions (séparation selon la charge):
Les colonnes échangeuses d'ions sont remplies de petites billes portant une charge soit positive, soit négative ; les protéines sont donc séparées en fonction de l'arrangement de leurs charges sur leur surface. Les matrices habituellement employées pour séparer des protéines sont le diéthylaminoéthylcelulose (DEAE-cellulose), qui est chargé positivement, et la carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) et la phosphocellulose, qui sont chargées négativement. Élution des protéines retenues Gradient de pH Gradient de force ionique

5 Chromatographie par hydrophobicité (selon l’hydrophobicité):
Les colonnes hydrophobes :contiennent des billes dont les chaînes latérales hydrophobes font saillie, de sorte que les protéines possédant des régions hydrophobes exposées sont retardées. En solution, les protéines à caractère hydrophobe cherchent davantage à s'associer entre elles qu'à s'hydrater avec les molécules d'eau. Des résines portant des groupements hydrophobiques (cycliques ou aliphatiques) permettent de retenir de telles protéines sur une colonne.  Les résines les plus utilisées pour ce type de chromatographie sont l'octyl- et le phényl-sépharose.

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7 Chromatographie d’affinité (Séparation selon l’affinité):
La chromatographie d'affinité, exploite la haute affinité de certaines protéines pour différents types d’effecteurs biologiques: Des degrés de purification très importants sont souvent atteints après un seul passage à travers une colonne d'affinité.

8 la chromatographie liquide à haute performance (HPLC):
 Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique.  La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique.  Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers le système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire.  En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

9 Etude de la composition des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide : (SDS-PAGE) (voir diapo) Détection immuno-électrophorétique des protéines ou western blot : (voir diapo) ELISA : (voir diapo)