Évaluation de l'efficacité virucide de l'hypochlorite de sodium et d'un composé oxydant non halogéné à base d'acide péracétique sur le Virus de l'Hépatite A et le Calicivirus Félin présents à la surface de laitues inoculées expérimentalement Temmam S(1), Burger C(2), Blaise-Boisseau S(2), Morin T(1), Perelle S(2) ADRIA Normandie Service R&D – Bd du 13 Juin 1944 BP2 14310 Villers Bocage. Tel : 02 31 25 43 00 AFSSA LERQAP VAE – 23, av. du Général de Gaulle 94706 Maisons Alfort. Tel : 01 49 77 27 99 INTRODUCTION : Les virus entériques peuvent être à l’origine de Toxi-Infections Alimentaires Collectives (TIAC). Leurs capacités de résistance intrinsèques représentent un problème majeur dans le cadre de la mise en place de mesures préventives en milieu industriel, notamment pour la détermination de barèmes de traitements technologiques et de doses de désinfectants à utiliser. Les végétaux frais sont parmi les matières premières à fort risque de contamination virale, notamment les salades qui peuvent être directement consommées par le consommateur après un lavage ménager, ou subir un lavage industriel en présence d’auxiliaire technologique pour être commercialisées sous forme 4e gamme. OBJECTIFS : Dans le cadre du projet ACTIA n°06.9 intitulé « Efficacité des péroxydes sur la destruction virale », nous avons comparé le potentiel virucide d’un produit oxydant non halogéné formulé contenant de l’acide péracétique (APA 5% +/- 0,5) avec celui de l’hypochlorite de sodium (Javel - 48° chlorométrique) en tant qu’auxiliaires technologiques dans le cadre d’un procédé expérimental de lavage de laitues. MATERIELS & METHODES : Des laitues artificiellement contaminées par le Calicivirus Félin (FCV) et par le Virus de l’Hépatite A (VHA) ont été soumises à un lavage par bullage, accompagné ou non d’ultrasons, puis soumises à l’action de l’hypochlorite de sodium (15 ppm de chlore actif) ou du produit oxydant non halogéné à base de péracides (100 ppm d’acide péracétique). Les efficacités virucides des deux produits ont été déterminées par recherche des virus infectieux (culture cellulaire) et par recherche de génomes viraux (RT-PCR en temps réel) à la surface des laitues traitées et dans les eaux de lavage. Cinq répétitions indépendantes ont été effectuées. Figure 1 : schéma expérimental de l’étude Laitue + Virus (FCV, VHA) Overnight 4°C 500mL eau de réseau 4°C Ultrasons 2min + bullage Auxiliaire technologique + agitation mécanique (bullage) Décrochage mécanique du virus Laitue artificiellement contaminée Action virucide de l’auxiliaire Eau de lavage Laitue potentiellement contaminée Neutralisation du produit Concentration par filtration Élution Virus Concentration par précipitation au PEG Analyse par qRT-PCR Analyse par culture cellulaire génome infectieux RESULTATS : Réductions logarithmiques des titres viraux infectieux et génomiques du FCV et du VHA artificiellement inoculés à la surface de laitues (moyennes de 5 expériences indépendantes) traitées par des auxiliaires technologiques. 15 ppm de chlore actif et 100 ppm d’APA employés en tant qu’auxiliaire technologique dans le procédé de lavage de laitues modélisé au laboratoire réduisent de façon similaire les titres infectieux du FCV et du VHA présents à la surface des laitues (respectivement –2.5 à –2.8 log10 de perte de titre infectieux pour le FCV et –1.6 à –1.1 log10 pour le VHA). La résistance observée du VHA est significativement plus importante que celle du FCV, modèle animal imparfait des norovirus humains. Pour ce qui est des réductions de titre viral dans les eaux de lavage, les titres viraux résiduels n’ont souvent pas pu être quantifiées en culture cellulaire. En effet, dans de nombreux cas, la présence de virus infectieux n’a pas été détectée dans les eaux de lavage ayant subi un contact avec l’auxiliaire technologique, ce qui suggère que les titres infectieux résiduels étaient inférieurs à la limite de détection de la méthode de titrage en culture cellulaire (figures 2, 3, 4). Des décalages entre niveaux de réduction du pouvoir infectieux et réduction de la quantité de génome ont été observés, en particulier pour le FCV (figure 2). Les amplicons de PCR en temps réel étant de petite taille, il serait intéressant d’évaluer l’impact potentiel de ces produits sur des portions de génome de taille plus importante. Les méthodes moléculaires peuvent apporter des informations sur le mécanisme d‘action des biocides, mais elles ne peuvent en aucun cas remplacer les méthodes de culture cellulaire pour l’évaluation de l’efficacité virucide d’un produit. Figure 2 : Réductions logarithmiques des charges virales de FCV présent à la surface des laitues et dans l’eau après lavage par bullage et ultrasons en présence d’auxiliaire technologique Figure 3 : Réductions logarithmiques des charges virales de VHA présent à la surface des laitues et dans l’eau après lavage par bullage et ultrasons en présence d’auxiliaire technologique Non détecté dans les 5 répétitions. Hypothèse : atteinte de la limite de détection de la méthode de titrage Non détecté pour 4 répétitions sur 5 Figure 4 : Réductions logarithmiques des charges virales du FCV et du VHA présent à la surface des laitues et dans l’eau après lavage par bullage et ultrasons en présence d’auxiliaire technologique +0.2 log10 +/- 0.4 -1.3 log10 +/- ND (ND pour 4 répétitions sur 5) Non détecté Infectieux +0.1 log10 +/- 0.2 -0.1 log10 +/- 0.2 -0.3 log10 +/- 0.9 -4.0 log10 +/- 0.6 Génome Eaux de lavage -1.1 log10 +/- 0.6 -1.6 log10 +/- 0.3 -2.8 log10 +/- 0.6 -2.5 log10 +/- 0.3 -1.4 log10 +/- 0.5 -1.3 log10 +/- 0.3 -0.3 log10 +/- 0.2 -1.5 log10 +/- 0.3 Laitues APA 100 ppm Javel 15 ppm Virus de l’hépatite A (VHA) Calicivirus félin (FCV) CONCLUSION : Les résultats de cette étude permettront de proposer aux industriels de la filière salade une alternative au lavage des laitues par le chlore. Cette étude souligne également l’inégale résistance des différents virus face aux traitements de désinfection et confirme le positionnement du virus entérique humain de l’hépatite A comme modèle de choix pour l’étude de l’efficacité virucide des traitements de décontamination. Projet co-financé par l’AFISE et l’ACTIA