“Transdifférenciation (plasticité)” astrocytes neurones oligodendrocytes Précurseurs neuronaux CERVEAU Révolution de dogmes: - passage au travers des feuillets embryonnaires ? -potentiel en médecine régénératrice ? PANCREAS (Seaberg 2004 Nat Biotech Choi 2004 Stem cells) pancreatic endocrine ß-, - and -cells, pancreatic exocrine, stellate cells FOIE hépatocytes Muscle squelettique MOELLE OSSEUSE CSH Brain to blood ! Cellules endothéliales Chondrocytes ostéocytes CŒUR cardiomyocytes PEAU Kératinocytes Fibroblastes Adipocytes (liposuccion) 1

Thérapie cellulaire: Réparer une fonction déficiente Reconstitution du tissu d'origine Reconstitution d'un tissu autre que celui d'origine (plasticité) Skeletal muscle 2

Isolement de cellules neurales Cerveau Cellules ES Promoter oct4- gfp/puromycin Isolement de cellules neurales puroR et gfp+

Isolement de cellules neurales cell fusion causes confusion! Cerveau Cellules ES Promoter oct4- gfp/puromycin Isolement de cellules neurales puroR et gfp+ 4

Malheureusement, l’Homme n’est ni une hydre, ni une salamandre… Fusion cellulaire Contaminant de cellules circulantes Population hétérogène (non clonale) 5

Pathologie létale du métabolisme hépatique Absence de l’enzyme Fah (fumarylacetoacetate hydroxylase) Réversion phénotypique par transplantation de CSH (Wang et al. (2003) Nature 422, 897-901) (Vassilopoulos et al. (2003) Nature 422, 901-904) Monocyte fah+/+ Pas d’expression dans cell hématop FAH Souris fah+/+ Hépatocyte

Greffe de Cellules Souches Hématop fah+/+ (c-kit+Lin-Sca1+) Guérison Facteurs régulateurs Greffe de Cellules Souches Hématop fah+/+ (c-kit+Lin-Sca1+) Hépatocyte B fah-/- Cytolyse Mort Souris fah -/- Souris fah+/+ Hépatocyte fah+/+ Monocyte fah+/+ FAH Pas d’expression dans cell hématop FAH : fumaroacetate hydroxylase

Greffe de Cellules Souches Hématop fah+/+ (c-kit+Lin-Sca1+) Hépatocyte B fah-/- Cytolyse Mort Souris fah -/- Souris fah+/+ Fusion Mo A fah+/+ X hépatocyte B fah-/- Hépatocyte fah+/+ Monocyte fah+/+ Facteurs régulateurs FAH Pas d’expression dans cell hématop FAH Guérison FAH : fumaroacetate hydroxylase

Fusion cellulaire Cellule hybride polyploïde Division réductionnelle

Difficultés de démontrer qu’une cellule est souche: Nécessité de caractériser sa descendance in vitro et/ou in vivo (vérification indirecte et rétrospective) mais: Placer la cellule dans des conditions expérimentales qui lui permettent d’exprimer toutes ses capacité de prolifération et de différenciation: Comment le faire puisqu’on ne connaît pas a priori ces conditions!! Comment être sûr qu’on altère pas les propriétés des CS en les manipulant? Analyser ces cellules individuellement (à l’échelle clonale) à cause de l’hétérogénéité des tissus d’origine et l’impossibilité des purification à homogénéité des cellules souches.

Lignages épidermiques au cours de l'embryogenèse cellules Ectodermales (K8/K18) Cellules souches Épidermiques (K5/K14) cellules neuronales épiderme K1/K10 Ectoderme K5/K14 Mésoderme annexes cutanées glande sébacée Gastrulation Follicule pileux K5/K14 K8/K18 K1/K10 E8.5 E18.5 E15.5 E9.5

La production de souris transgéniques a permis d'identifier des gènes directement impliqués dans la formation et le renouvellement de l'épithélium cutané, dans son maintien et dans l'engagement folliculaire et sébocytaire: p63, c-myc, beta-caténine, LEF1

épiderme derme

(prolifération cellulaire, (ubiquitine/protéasome) Beta-caténine wnt  Gènes cibles (myc,…) (prolifération cellulaire, apoptose) LEF1 DSH (dishevelled)   Dégradation (ubiquitine/protéasome) P GSK-3ß  cadhérine

Souris transgénique (constitutive ß-cat) L'expression constitutive de la ß-caténine accélère la production massive de nouveaux poils (qui normalement se forment eu cours de l'embryogenèse), mais désorganisée aboutissant à la formation de pilocarcinomes, trichofolliculomes et pilomatricomes. Souris sauvage Souris transgénique (constitutive ß-cat) Peau plus épaisse et poils plus touffus Formation de novo de follicules pileux dans l'épiderme interfolliculaire

ß-catenin sebaceous gland hair follicles stem cells interfollicular Formation à partir de l'épiderme de multiples follicules pileux désorganisés, non orientés qui forment des cystes. Au début, la différenciation est normale mais au fur et à mesure, la non polarité des invaginations aboutit à la formation de trichofollicules (semblable aux pathologies humaines). Ces cystes expliquent l'épaisseur de la peau des souris. A 6 semaines, le poil des souris est au repos (phage anagène) et ne repousse pas. Par contre, pour les souris transgéniques, une complète croissance de novo des poils a lieu en 14 jours. ß-catenin sebaceous gland hair follicles stem cells interfollicular epidermis ? sebaceous gland hair follicles stem cells interfollicular epidermis ?

Souris sauvage Souris KO ß-cat) ß-caténine

sebaceous gland interfollicular epidermis KO de ß-cat avant la fomation des f. pileux: KO de ß-cat après la fomation des f. pileux: absence de placodes, épaississement de l'épiderme les poils sont totalement perdus après le premier cycle pileux. ß-caténine est essentielle dans l'engagement des SC: en son absence, les SC ne peuvent se différencier en poils, au profit de l'épiderme. ß-catenin sebaceous gland hair follicles stem cells interfollicular epidermis ?

cellule souche follicule pileux Rôle majeur de la ß caténine dans la formation de l'épiderme et des annexes épiderme glande sébacée cellule souche bulge ß caténine LEF-1 BMP-4 follicule pileux

Rôle majeur de la ß caténine dans la formation de l'épiderme et des annexes glande sébacée cellule souche bulge

cellule souche follicule pileux Rôle majeur de la ß caténine dans la formation de l'épiderme et des annexes épiderme cellule souche bulge + ß caténine Tumeurs folliculaires follicule pileux

Augmentation de la fonction sébocytaire (red oil) c-myc (oncogène, TF, prolifération, croissance cellulaire et différenciation) Les souris adultes perdent progressivement leurs poils et développent des plaies chroniques. Souris sauvage Souris transgénique Augmentation de la fonction sébocytaire (red oil) Hyperplasie épidermique; disparition locale d'épiderme

c-Myc est essentiel au maintenance du pool souche. Souris sauvage Souris transgénique Augmentation de la prolifération (BrdU) c-Myc est essentiel au maintenance du pool souche. Réduction de 75% du nombre de CSE. sebaceous gland hair follicles stem cells interfollicular epidermis c-myc sebaceous gland hair follicles stem cells interfollicular epidermis

Les niveaux d'expression de Myc influencent le devenir des CSE. Souris sauvage Souris transgénique Endogenous c-myc controls mammalian epidermal cell size, hyperproliferation, and stem cell amplification. Zanet J., Pibre S., jacquet C., Ramirez A., MorenodeAlboran I. and Gandarillas A. (2005) J Cell Sciences, in press. L'absence (KO) de c-myc dans la basale provoque une fragilité sévère d'un épiderme fin (hyperkératosique), dans les zones de friction et une différenciation prématurée. Appauvrissement en CS et réparation cutanée défectueuse. Les niveaux d'expression de Myc influencent le devenir des CSE.

homéostasie Surexpression de c-Myc Absence de c-Myc TD TA c-Myc c-Myc SC Hyperplasie épidermique Perte de poils Plaies chroniques Fragilité chronique de l’épiderme Différenciation prématurée Réparation défecteuse