Inhibition enzymatique Enzymologie Inhibition enzymatique

Prof. Jeffrey W. Keillor courriel : jw.keillor@umontreal.ca site-web : http://www.esi.umontreal.ca/~keillorj/ tél : 343-6219 local : F-516 période de disponibilité : par rendez-vous notes de cours et diapos disponibles sur ma page web

Inhibition enzymatique inactivation d’une enzyme (ralentissement de la réaction enzymatique) par la liaison d’une petite molécule différente que la dénaturation

Types d’inhibition réversible irréversible compétitive incompétitive noncompétitive irréversible par marqueur d’affinité par inhibition suicide

Inhibition compétitive la liaison de l’inhibiteur, à l’enzyme libre, empêche la liaison du substrat

Inhibition compétitive alternative la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, empêche la liaison du substrat par encombrement stérique la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, induit un changement conformationnel qui empêche la liaison du substrat

Exemple de l’inhibition compétitive l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison : l’oxaloacétate est aussi un inhibiteur compétitif: HO2C-CO-CH2-CO2H

J. Biol. Chem. (2006) 281, 5965-5972.

Équations pour l’inhibition comp. conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•I] substitution en fonction de E•S : état stationnaire : constante d’inhibition : KM augmente

Graphique d’inhibition compétitive

Graphique d’inhibition compétitive lignes se croisent sur l’axe-y (1/Vmax)

Graphique d’inhibition compétitive lignes se croisent sur l’axe-y (Vmax)

Détermination de Ki (compétitive) équation pour l’augmentation de KM : ou les pentes LB (KM/Vmax)

Équation pour IC50 (compétitive) équations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 : N.B. : IC50 > Ki

Inhibition incompétitive l’inhibiteur est lié par le complexe E•S ne mène pas aux produits

Exemple de l’inhibition incompétitive inhibition de la phosphatase alkaline par la L-phénylalanine: ne mène pas aux produits

J. Mol. Biol. (2005) 350, 441–451

Équations pour l’inhibition incomp. conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I] substitution en fonction de E•S : état stationnaire : constante d’inhibition : [E]0 = [E•S] + + KM et Vmax diminuent

Graphique d’inhibition incompétitive

Graphique d’inhibition incompétitive lignes parallèles

Graphique d’inhibition incompétitive lignes se croisent sur l’axe-x (Vmax/KM)

Détermination de Ki (incompétitive) équation pour la diminution de Vmax : ou bien 1/KM

Équation pour IC50 (incompétitive) équations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 : N.B. : IC50 > Ki

Inhibition non-compétitive l’inhibiteur est lié par l’enzyme libre et par le complexe E•S ne mène pas aux produits

Exemple de l’inhibition non-comp. inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP : ne mène pas aux produits

Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 12482-12486

Équations pour l’inhibition noncomp. conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I] + [E•I] substitution en fonction de E•S : état stationnaire, constantes d’inhibition (Ki et Ki') Vmax diminue; KM peut augmenter ou diminuer

Inhibition non-compétitive simple l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e. Ki = Ki') KM n’est pas affecté Vmax est diminué par le facteur de

Graphique d’inhibition non-compétitive simple

Graphique d’inhibition non-compétitive simple lignes se croisent sur l’axe-x (-1/KM)

Graphique d’inhibition non-compétitive simple lignes parallèles

Détermination de Ki (non-compétitive simple) équation pour la diminution de Vmax :

Inhibition non-compétitive mixte l’affinité de l’inhibiteur dépend de la présence de substrat (i.e. Ki  Ki') Vmax est toujours diminué par le facteur de KM est affecté selon Ki et Ki'

Inhibition non-compétitive mixte lorsque Ki < Ki', KM augmente et l’inhibition ressemble à l’inhibition compétitive : lignes se croisent entre les axes

Inhibition non-compétitive mixte lorsque Ki > Ki', KM diminue et l’inhibition ressemble à l’inhibition incompétitive : lignes se croisent en-dessous l’axe-x

Détermination de Ki' (non-compétitive mixte) équation pour la diminution de Vmax : ' '

Détermination de Ki (non-compétitive mixte) équation pour la variation de KM :

Équation pour IC50 (non-comp. simple) équations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 : N.B. : seulement Vmax est affecté par I; cet effet est indépendant de [S]

Graphiques de Dixon façon alternative pour déterminer la valeur de Ki en faisant un graphique de 1/v vs [I] pour l’inhibition compétitive et non- compétitive simple, les lignes se crosient où [I] = -Ki pour inhibition incompétitive, les lignes sont parallèles et c’est impossible de mesurer la valeur de Ki de cette façon

Graphique de Dixon (compétitive) lignes se croisent où [I] = -Ki

Graphique de Dixon (non-comp. simple) lignes se croisent où [I] = -Ki

Graphique de Dixon (incomp.) lignes ne se croisent pas

Mécanisme d’inhibition le mode d’inhibition peut donner des informations sur le mécanisme d’inhibition faisons l’analyse cinétique détaillée du schéma suivant :

Mécanisme d’inhibition vitesse : v = k7 [E'S] conservation de masse : [E]T = [E] + [E'] + [E'•S] + [E • I] cste d’inhibition : état stationnaire pour E'•S : état stationnaire pour E' : alors : donc :

Mécanisme d’inhibition d’où vient : et : équation Michaelis-Menten pour inhibition : Vmax diminue; KM peut augmenter ou diminuer inhibition non-compétitive!!

Mécanisme d’inhibition l’inhibiteur ne se lie pas à la forme de l’enzyme qui lie le substrat; donc, pas compétitif l’inhibiteur ne se lie pas au complexe enzyme-substrat; donc, pas incompétitif donc, l’inhibiteur est non-compétitif on voit que les profils d’inhibition ne sont pas exclusifs pour un seul type de mécanisme

Inhibition de réaction avec multiples substrats pour élucider un mécanisme enzymatique, on peut étudier l’effet cinétique de la variation des : substrats : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [S2]; 1/v vs 1/[S2] en fonction de [S1]… produits : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [P1], [P2]; 1/v vs 1/[S2] en fonction de [P1], [P2]… inhibiteurs : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2]; 1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2]… le patron d’inhibition observée aide surtout à déterminer l’ordre de liaison des substrats

Inhibition d’un mécanisme ordonné par exemple, pour le schéma ci-dessus : I1 est compétitif avec B et incompétitif avec A I1 lie la même forme de l’enzyme que B, et se lie après A I2 est compétitif avec A et non-compétitif avec B I2 lie la même forme de l’enzyme que A, et se lie avant B

Règles de Cleland dans le cas où I se lie à E avant S, l’inhibition est : compétitive lorsque : i) I et S lient la même forme de E, ou ii) I et S se lient à deux formes de E en équilibre rapide incompétitive lorsque : I et S se lient à des formes différentes de E séparées par une étape irréversible non-compétitive lorsque : I et S se lient à des formes différentes de E reliées par une réaction réversible ou une séquence de réactions réversibles

Règles de Cleland dans le cas où I se lie à E après S, l’inhibition est : incompétitive - toujours.

Analyse selon les règles de Cleland inhibition par inhibiteur, I S et I lient la même forme d’enzyme? non S se lie avant I? toutes étapes entre I et S sont réversibles? non non incomp. compétitive oui incompétitive oui oui non-compétitive

Inhibition d’un mécanisme ordonné 1/v vs 1/[A] comp. incomp. 1/v vs 1/[B] non-comp. 1/v vs 1/[C]

Exercice: Ordre de liaison de substrats dessinez le schéma mécanistique ordonné, en précisant l’ordre de liaison des substrats A et B et de l’inhibiteur I, étant donné le patron suivant de modes d’inhibition : I1 1/v vs 1/[A] comp. 1/v vs 1/[B] incomp.

Règles de Cleland – étapes irrév. une étape est considérée d’être irréversible si elle implique : la dissociation d’un produit (où [P] » 0) la liaison d’un substrat (où [S] » saturante) un grand changement d’énergie libre (où DG°<<0)

Inhibition d’un mécanisme ordonné irréversible aux concentrations non-saturantes de substrats : Si I se lie à : 1/v vs 1/[A] 1/v vs 1/[B] 1/v vs 1/[C] E comp. non-comp. incomp. E•A E•A•B F E•Q•R E•R non-comp.

Règles de Cleland dans le cas où E est inhibée par les produits de la réaction ([P]  0 !), l’inhibition est : compétitive lorsque : P et S se lient à la même forme de E incompétitive lorsque : P et S se lient à des formes différentes de E séparées par une étape irréversible non-compétitive lorsque : P et S se lient à des formes différentes de E reliées par une réaction réversible ou une séquence de réactions réversibles

Analyse selon les règles de Cleland inhibition par produit, P vers la fin d’une réaction, où [P]  0 S et P lient la même forme d’enzyme? toutes étapes entre P et S sont réversibles? non non incompétitive compétitive oui oui non-compétitive

Inhibition d’un mécanisme ordonné Inhibition par produit: Substrat variable : Profils aux conc. non-saturantes : Si [A] est saturante : Si [B] est saturante : Q A comp. B non-comp. pas d’inhib. P incomp.

Inhibition d’un mécanisme ping-pong Inhibition par produit: Substrat variable : Profils aux conc. non-saturantes : Si [A] est saturante : Si [B] est saturante : Q A comp. B non-comp. pas d’inhib. P

Inhibition de liaison lente parfois l’équilibre de liaison d’inhibiteur est lent à atteindre pour les inhibiteurs lents, ça prend des secondes ou minutes pour atteindre l’état stationnaire, plutôt que des millisecondes l’affinité peut quand même être forte (Ki faible) mais les constantes de vitesses pour les étapes de liaison et dissociation sont petites

Effet cinétique de la liaison lente établissement lent de l’équilibre entre l’enzyme libre et le complexe E•I : (cf liaison rapide)

Inhibition par liaison lente à forte affinité inhibition classique : ça prend beaucoup de I [I] et [S] >> [E] [I] » [I] ajoutée (équilibre rapide et constant) v µ [E], en absence et en présence de l’inhibiteur inhibition de forte affinité : ça prend peu de I [I] » [E] [I] ¹ [I] ajoutée (la formation de E•I réduit [I] libre) v vs [E] n’est pas linéaire

Exemple de l’inhibition lente à forte affinité les enzymes effectuent la catalyse en stabilisant l’état de transition d’un réaction; alors, elles ont beaucoup d’affinité pour des analogues d’état de transition 5'-méthylthioadenosine/S-adenosylhomocystéine nucléosidase (MTAN) catalyse l’hydrolyse du nucléoside en base et thioribose :

Exemple de l’inhibition lente à forte affinité des études mécanistiques suggèrent l’allure que devrait avoir l’état de transition de la réaction, et la modélisation a aidé la conception des analogues :

Exemple de l’inhibition lente à forte affinité des analogues d’état de transition donnent souvent l’inhibition lente parce que l’enzyme ajuste sa conformation comme elle ferait lors de la catalyse : très stable

J. Biol. Chem. 2005, 280, 18274

Identification de l’inhibition à forte affinité les concentrations (mesurées) de l’enzyme et de l’inhibiteur sont similaires le Ki est très faible et/ou la régénération de l’enzyme est lente (petite k-i) l’inhibiteur est difficile à séparer de l’enzyme (par dialyse ou filtration de gel) le degré d’inhibition varie avec la concentration d’enzyme (IC50 ­ avec [E]) les courbes de Ackermann-Potter (v vs [E]) ne sont pas linéaires

Exemple de l’inhibition de forte affinité le methotrexate est un analogue de l’acide folique qui inhibe très fortement et de manière compétitive la réductase de dihydrofolate (DHFR) Ki est de 6 × 10-11 M et la demi-vie de E•I est de plusieurs heures in vivo , DHF , MTX à calculer !

J. Mol. Biol. (2000) 295, 307-323

Courbes de Ackermann-Potter concs. similaires

Courbes de Ackermann-Potter à Ki > [E] et [I], faible déviation de la linéarité :

Courbes de Ackermann-Potter à Ki < [E] et [I], forte déviation de la linéarité :

Courbes de Ackermann-Potter à Ki << [E] et [I], très forte déviation de la linéarité :

Courbes de Ackermann-Potter à Ki <<< [E] et [I], on a le titrage stoechiométrique : pas d’inhibition; v  [E] à [E]>[I] ligne décalée par [I]

Équations pour IC50 (forte affinité) équations pour les trois modes d’inhibition réversible : Mode d’inhibition Équation compétitif incompétitif non-compétitif (simple) N.B. : IC50  ½ [E]T

Tableau sommaire des inhibiteurs réversibles Classe d’inhibiteur Relation entre [E]T et [I]T Atteint de l’équilibre entre E, I et E•I Traites caractéristiques classique [I]T >> [E]T rapide ·    IC50 ne dépend pas de [E]T ; v vs [E]T linéaire ·    [P] vs temps linéaire « tight-binding » [I]T » [E]T ·    IC50 dépend de [E]T ; v vs [E]T non-linéaire « slow-binding » lent ·    IC50 ne dépend pas de [E]T ; v vs [E]T linéaire ·    [P] vs temps non-linéaire « slow, tight-binding » ·    IC50 dépend de [E]T ; v vs [E]T non-linéaire

Inhibition irréversible pour des inhibiteurs réversibles, on utilise le Ki comme un indice de l’efficacité de l’inhibition pour les inhibiteurs irréversibles, on utilise le kinact et le KI il y a deux types d’inhibiteurs irréversibles : réactifs du site actif (marquage par affinité) inhibiteurs basés sur le mécanisme (substrats « suicide »)

Marqueurs par affinité démontrent la spécificité envers un groupement fonctionnel des acides aminés du site actif analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans les site actif comprennent aussi un groupement réactif (pharmacophore) – typiquement un électrophile qui réagit avec un nucléophile dans le site actif possèdent un seul site saturable et réagissent de manière stœchiométrique (1 mol de I/mol de E)

Marquage par affinité l’enzyme est protégée contre cette inhibition par le substrat (ou co-facteur) la perte d’activité suit une cinétique de premier ordre, parce que l’enzyme est consommée comme un réactif pendant la réaction l’inhibition est accompagnée de la modification covalente de l’enzyme : l’enzyme demeure inactive après la séparation de l’excès de l’inhibiteur l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou filtration sur gel (ou sur membrane) même après la dénaturation de l’enzyme

Exemples de marquage par affinité TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone) ressemble un amide de la phénylalanine, mais le groupement chlorométhyle cétone effectue l’alkylation de la His57 de la chymotrypsine :

Exemples de marquage par affinité DIFP (diisopropyl phosphofluoridate) réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine :

Exemples de marquage par affinité PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) utilisé pour inhiber des protéases et réagit aussi avec des résidus de sérine  :

Exemples de marquage par affinité Autres exemples : Enzyme Substrat Marqueur par affinité Triosephosphate isomerase Lysozyme Isoleucyl-tRNA synthetase

Marquage par photoaffinité on utilise des inhibiteurs qui sont stables en absence de lumière et activés par la photolyse après association avec l’enzyme deux exemples : les groupes diazo qui génèrent des carbènes : les azotures qui génèrent des nitrènes :

Réactions du groupement nitrène (peut réagir avec n’importe quoi !!)

Analyse cinétique liaison rapide à l’équilibre de l’inhibiteur suivie de la formation lente et irréversible d’un complexe inactif : la proportion d’enzyme sous forme E•I augmente avec la concentration de I E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre

Mesure de kinact kinact peut être déterminée en mesurant la perte d’activité en fonction du temps (kobs) à différentes concentrations d’inhibiteur :

Mesure de kinact l’activité qui reste à un moment donné est proportionnelle à la concentration totale des formes d’enzyme qui ne sont pas inactivées : e = [E] + [E•I] vitesse d’inactivation : constante d’inhibition : alors et après intégration : relation hyperbolique; cf équation M-M

Mesure de kinact forme double réciproque : graphique linéaire :

Mécanisme d’inactivation si la cinétique d’inactivation est de seconde ordre, l’inactivation se fait entre E et I en solution si la cinétique d’inactivation est de premier ordre, l’inactivation a lieu à partir du complexe E•I si l’enzyme est protégé par le substrat, l’inhibiteur se lie au site actif de l’enzyme : protection partielle; inhibition irréversible

Modification sélective indiquée par : la formation d’un complexe stœchiométrique (1:1) entre E et I correspondance entre les cinétiques d’inhibition et le degré d’incorporation covalente de l’inhibiteur sur l’enzyme :

Inhibiteurs basés sur le mécanisme aussi appelés des « substrats suicides », ils doivent être activés par l’enzyme : la plupart ont des kcat de 103 à 105 fois plus faibles que le substrat naturel (étape lente) même cinétiques de saturation et la réaction d’inactivation du premier ordre que celles des réactifs du site actif (marqueurs par affinité)

Démonstration de kcat au mécanisme deux critères pour impliquer le mécanisme d’action d’une enzyme au mécanisme d’inactivation : l’inactivation est dépendante de la présence de cofacteur ou d’un deuxième substrat d’autres informations mécanistiques de la réaction d’inactivation concordent avec celles déterminées pour la réaction normale du substrat naturel par exemple : effets isotopiques, profil pH-vitesse, etc.

Groupements activés typiquement électrophiles

Exemple de réactions « suicide » inhibition de la déshydrase de thiolester b-hydroxydécanoyle par un analogue acétylène : réaction normale avec son substrat:

Exemple de réactions « suicide » inhibition de la déshydrase de thiolester b-hydroxydécanoyle par un analogue acétylène : réaction suicide avec un analogue acétylène: même effet isotopique; même mécanisme

Exemple de réactions « suicide » inhibition de la b-lactamase par des analogues de pénicilline :

Exemple de réactions « suicide » inhibition des transaminases par un analogue d’acide aminé : formes inactives

Inhibition et formation de produit typiquement, une certaine quantité d’inhibiteur est transformée en produit, sans inactivation de l’enzyme le rapport r = k3/k4 représente la proportion molaire pour l’inactivation; le nombre de fois que le substrat est transformé en produit pour chaque fois qu’il inhibe plutôt r est constante et indépendante de la concentration de substrat ou d’enzyme; elle représente le partage d’un intermédiaire commun, E•I

Tableau sommaire des modificateurs chimiques

Tableau sommaire des modificateurs chimiques

Tableau sommaire des modificateurs chimiques

Tableau sommaire des modificateurs chimiques