INVASION METASTATIQUE DU TISSU OSSEUX : ROLE DES INTERACTIONS CELLULES / CELLULES ET CELLULES/MATRICE Journées pédagogique et scientifique AE2BM Marseille 2006 S. KAMEL Unité de recherche sur les mécanismes de la résorption osseuse (URMRO) INSERM ERI 12 Faculté de Pharmacie - Amiens

- Traitements très difficiles et encore rares Métastases osseuses = complications de nombreux cancers Tumeurs solides (sein, prostate) hémopathies malignes (myélome multiple) Tissu osseux = site secondaire +++ (ostéophilie) Les métastases sont responsables : Fractures ++ Douleurs osseuses ++ syndromes de compression nerveuse Episodes d’hypercalcémie Morbidité +++ - Traitements très difficiles et encore rares Problème majeur de santé publique

EPIDEMIOLOGIE DES METASTASES OSSEUSES Morbidité osseuse (évènements osseux /an) Incidence dans la maladie avancée Myélome 95-100% 2 Sein 65-75% 3,5-3,8 Prostate 65-75% 3 Thyroïde 60% Poumon 30-40% Rein 20-25% Mélanome 14-45%

Processus métastatique général Tumeur primitive Métastase ganglionnaire Dissémination lymphatique Dissémination hématogène Métastase secondaire à distance Métastase primaire à distance (Pantel, Nat. Rev. Cancer,2004)

Physiopathologie de l’établissement de la métastase dans le tissu osseux Organe cible =tissu osseux Organe cible = cavités médullaires Tumeur primitive Micro-environnement médullaire circulation Prolifération Invasion Angiogenèse Intravasation Extravasation Adhésion Echanges d’informations biologiques Etablissement de la métastase osseuse : Ostéolytique Ostéocondensante Mixte

Ostéophilie des cellules tumorales : de vieux concepts … Sir Stephen Paget 1889 : le père du « homing » Théorie du « seed and soil » La graine = cellule cancéreuse : propriétés d’adressage vers le tissu osseux. Le sol = le micro-environnement osseux : terrain fertile à la croissance tumorale.

Facteurs favorisant l’adressage spécifique des cellules tumorales dans le tissu osseux ? (rôle des chimiokines, des intégrines)

Etudes avec puces à DNA: Van’t Veer et al. Nature 2002 : signature génique de l’agressivité d’une tumeur du sein (gènes contrôlant le cycle cellulaire, l’angiogenèse et l’invasion tumorale). Kang et al. Cancer cell, 2003 Minn et al. JCI, 2005 : étude sur la lignée MDA-MB231 Inoculation intra-cardiaque des Cellules MDA-MB231à la souris Nude Sélection d’un clone cellulaire hautement métastatique Analyse génique : Interleukine 11 (IL11) , le connective tissue growth factor (CTGF), MMP1, ostéopontine, CXCR4 Acquisition du phénotype métastatique osseux

Rôle de CXCR4 Récepteur de chimiokines exprimé +++ par les cellules fortement invasives SDF-1 (stromal derived factor) produit en quantité importante par les cellules médullaires Anticorps anti-CXCR4 diminue l’invasion métastatique (organes lymphoïdes, poumon) dans un modèle de souris Expression de CXCR4 stimulée par des facteurs présents dans la matrice osseuse

Rôle de l’intégrine alpha V ß3 Surexpression alpha V beta 3 ostéolyse intense Pecheur et al. FASEB, 2002

Pecheur et al. FASEB, 2002

Conséquences thérapeutiques : inhibition des métastases osseuses par des petits peptides antagonistes de vß3 (Harms JF et coll, Clin Exp Metastasis, 2004)

RANK Ligand régule la migration des cellules cancereuses et a formation de métastases osseuses RANK Ligand stimule la migration de cellules cancéreuses exprimant RANK in vitro L’inhibition du RANKL réduit les métastases tumorales de l’os tumeur + OPG Holstead Jones et al. Nature Vol 440 (692-696) 2006

Le calcium - extracellulaire via le récepteur sensible au calcium (CaR) régule la migration des cellules cancéreuses

Effets de l’acide lysophosphatidique (LPA) Boucharaba et al, JCI 2004 Boucharaba et al, PNAS 2006

Facteurs de croissance et cytokines Le tissu osseux = sol fertile pour les cellules tumorales Ostéoclastogenèse Ostéoblastogenèse Facteurs de croissance et cytokines Cellules tumorales dans l’os Modification +++ du remodelage osseux local Cercle vicieux d’auto-entretien TGFb, IGF, Ca++ Ostéoclaste mature Résorption osseuse Os

CONSÉQUENCES DU DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTASTASE DANS LE TISSU OSSEUX : DÉSÉQUILIBRE DU REMODELAGE OSSEUX

Os Résorption osseuse Formation osseuse Ostéoblastes Cellules tumorales dans l’os Ostéoblastes Ostéoclaste mature Os Résorption osseuse Formation osseuse

RAPPEL SUR LE REMODELAGE OSSEUX PHYSIOLOGIQUE

HOMÉOSTASIE CALCIQUE ET TISSU OSSEUX Apports alimentaires (1000 mg Ca++) Absorption Formation Calcémie (2,2-2,6 mM) squelette 1000 g intestin Sécrétion Résorption Compartiment extra-cellulaire Réabsorption filtration Fèces rein Urine Rôle du tissu osseux dans les échanges calciques vers et à partir des liquides extra-cellulaires

LES DIFFÉRENTES SÉQUENCES DU REMODELAGE OSSEUX ostéoclastes Cellules bordantes ACTIVATION Matrice osseuse Matrice osseuse QUIESCENCE RESORPTION Os calcifié nouveau Ostéoclastes actifs Ostéoblastes Os calcifié ancien Durée : 12 jours Durée : 3 mois INVERSION FORMATION . ? . . . Remodelage osseux dépend du nombre de cellules osseuses (Oc et Ob) activées L’équilibre du Remodelage osseux assure l ’intégrité de la masse osseuse

Résorption osseuse et ostéoclaste monocyte macrophage ostéoblaste M-CSF CFU-GM Interactions cellule-cellule Cellule souche totipotente prolifération fusion activation Cathepsines Métallo-protéases Engagement Précurseurs ostéoclastiques Ostéoclaste H+ H+ Matrice osseuse Régulation 2 Ostéoclaste activé résorbant Régulation 1 12 j Régulation 3 Détachement et mort par apoptose

Ostéoblastes/Cellules stromales Prolifération et différenciation RÔLE DES INTERACTIONS OSTÉOBLASTES / OSTÉOCLASTES DANS LA DIFFÉRENCIATION OSTÉOCLASTIQUE : La triade RANK-RANKL et OPG M-CSF RANK OPG RANK-L M-CSF OPG Ostéoblastes/Cellules stromales Précurseur ostéoclastique RANK Prolifération et différenciation Survie, fusion, et activation Ostéoclaste activé Pré-ostéoclaste RANK : Receptor Activator of Nuclear factor kappa B RANK-L : RANK ligand OPG : Ostéoprotegérine M-CSF : Macrophage Colony Stimulating Factor

DMO accrue (ostéopétrose) Le rôle du récepteur RANK et du RANK Ligand dans la régulation de la densité minérale osseuse Normal Absence de RANK Ligand1 Absence de RANK2 DMO accrue (ostéopétrose) 1 Kong YY et al. Nature 1999; 397: 315–323; 2 Li J et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 1566–1571

L’excès de RANKL chez les souris OPG -/- entraîne des fractures de fragilité spontanées des os longs Radiographie de souris OPG knockout mouse à un mois avec fractures de fragilité spontanées Bucay et al, Genes and Development 12: 1260-1268, 1998

Stimule ++ ostéoclastogenèse CONTRÔLE DE LA RÉSORPTION OSSEUSE Facteur Effet stimulant Effet inhibiteur + Calcitriol Parathormone T3 et T4 17ß oestradiol Calcitonine Stimule ++ ostéoclastogenèse HORMONAL + + TNF a IL 1 IL 6 Prostaglandines LOCAL

Ostéoblastes/ Cellules stromales CONTRÔLE DE LA RÉSORPTION OSSEUSE = CONTRÔLE DE LA BALANCE RANK-L/OPG OPG RANK-L Agents hyper résorbants : Agents hypo résorbants 17 ß oestradiol 17 ß oestradiol + - - + OPG Ostéoblastes/ Cellules stromales RANK-L PTH 1,25 (OH) D3 IL1 TNFa Glucocorticoïdes

Cellule souche mésenchymateuse Précurseur ostéoblastique L ’OSTÉOBLASTE ET LA FORMATION OSSEUSE Cellule souche mésenchymateuse Myo D - myoblastes Expression de Cbfa1 et ostérix PPAR g - adipocytes Cellules ostéoprogénitrices SOX 9 Cbfa1 Voie ostéoblastique - chondroblastes Précurseur ostéoblastique - Phosphatase alcaline - Collagène type I - Ostéocalcine - Sialoprotéine osseuse Ostéoblaste mature Cellule bordante ostéocyte Ostéoblaste apoptotique

Facteurs de transcription et différenciation ostéoblastique Rôle de CBFA1 (Core Binding Factor alpha 1 ou RUNX 2) Souris normale Souris CBFA1- - Souris CBFA1- - Souris normale

Dégradation par le protéasome Contrôle de la formation osseuse par le système Lrp 5 / Wnt Souris Lrp5-- : diminution (-50%) nombre Ob et FO Wnt (Wingless) : stimulation ++ prolifération et différenciation ob Wnt Sfrp (soluble frizzled related protein) Lrp 5 Lrp 5 Krm (Kremen) Frizzled Dkk (dickopf 1) Kinase ? P P Protéine adaptatrice Dégradation par le protéasome ß caténine ß caténine Cyclin D1, C myc Gènes Ob Ostéoblaste

CONTRÔLE DE LA FORMATION OSSEUSE Facteur Effet stimulant Effet inhibiteur + Calcitriol PTH (1-34) 17ß oestradiol Leptine HORMONAL + BMP (bone morphogenetic protein) TGFß IGF, FGF Contraintes mécaniques TNFa + LOCAL +

DÉRÉGULATIONS PATHOLOGIQUES DU REMODELAGE OSSEUX AU COURS DE L’INVASION MÉTASTATIQUE Résorption (Ostéoclastes) Formation (Ostéoblastes) Maintien de la masse osseuse Cellules tumorales Formation Résorption Résorption Formation Perte de masse osseuse Gain de masse osseuse Tumeur ostéolytique (sein, myélome) Tumeur ostéocondensante (sein,prostate)

Mécanismes moléculaires responsables de l ’atteinte osseuse métastatique des tumeurs ostéolytiques : cas du sein RANK Ligand: médiateur essentiel de la destruction osseuse dans le cancer métastatique Cellules cancéreuses dans la métastase osseuse Cytokines et facteurs de croissance PTHrp IL-6, 8, 11 Facteurs de croissance RANK Ligand Ostéoclaste Résorption osseuse Ostéoblaste RANK RANK Ligand Os Lésions ostéolytiques Adapté d’après Roodman GD. N Engl J Med 2004; 350: 1655–1664

Mécanismes moléculaires responsables de l ’atteinte osseuse métastatique des tumeurs ostéolytiques : cas du myélome multiple RANK Ligand: médiateur essentiel de la destruction osseuse dans le myélome multiple Plamocytes tumoraux médullaires Cytokines et facteurs de croissance MIP 1  et ß IL-6 Facteurs de croissance RANK Ligand Ostéoclaste Résorption osseuse Ostéoblaste RANK RANK Ligand Os Lésions ostéolytiques

Cellules myélomateuses Pathologie osseuse associée au myélome multiple : Facteurs diminuant la formation osseuse Cellules myélomateuses Il 7 DKK1 cbfa1 Lrp5 : wNT Ostéoblaste Ostéoblaste Os Lésions ostéolytiques

Cellules prostatiques et mammaires Mécanismes moléculaires responsables de l ’atteinte osseuse métastatique des tumeurs ostéoblastiques : (Prostate, sein) Cellules prostatiques et mammaires Endothelin 1 FGFs, BMP ? CBFA1 Ostéoblaste Ostéoblaste Os Lésions ostéolytiques

CONSÉQUENCES POUR LE TRAITEMENT DES METASTASES OSSEUSES

RANKL = Nouvelle cdible thérapeutique dans le traitement des métastases osseuses Ostéoclaste RANK Ac anti-RANKL RANK soluble OPG RANKL Ostéoblaste

Modèle intracardiaque MDA-231 Nombre de lésions par souris L’inhibition du RANK Ligand par L’OPG recombinante bloque l’ostéolyse tumorale dans un modèle de cancer du sein Modèle intracardiaque MDA-231 4 Lésions radiographiques Nombre de lésions par souris 2 * * 0,3 1 3 Dose d’OPG (mg/kg) 0,3 1 3 60 120 180 Dose d’OPG (mg/kg) * NOc /mm2 de surface tumorale Témoin OPG Morony S et al. Cancer Res 2001; 61(11): 4432–4436

L’inhibition du RANK Ligand par l’OPG recombinante réduit la charge tumorale et améliore la survie dans un modèle murin de myélome multiple 3,5 *p < 0,05 3,0 * 2,5 1,0 p<0,02 Paraprotéine (g/dl) 2,0 0,8 1,5 5T33MM + Témoin 0,6 1,0 5T33MM + OPG Survie cumulative 0,4 90 85 0,2 * 80 % de cellules tumorales 5 10 15 20 25 30 35 40 75 Jours 70 65 Normal 5T33MM + Témoin 5T33MM + OPG (25 mg/kg) Vanderken K et al. Cancer Res 2003; 63: 287–289

Inhibition du RANK Ligand L’inhibition du RANK Ligand par le du RANK soluble diminue la formation des lésions osseuses ostéoblastiques induites par le cancer de la prostate Modèle LuCaP 35 Hu/SCID de cancer de la prostate, thérapie initiée à 6 semaines Inhibition du RANK Ligand ( RANK soluble) Basal Témoin PSA sérique en tant que marqueur de substitution de la charge tumorale dans le cancer de la prostate 40 35 30 Radiographie 25 * PSA (ng/ml) 20 15 10 5 Basal Témoin RANK soluble Zhang J et al. Cancer Res 2003; 63: 7883–7890

Cellules spécialisées Limite dans l’utilisation en thérapeutique humaine de l’OPG Cellules spécialisées Ostéoclaste RANK TRAIL TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Lingand) : signal de mort pour les cellules tumorales OPG RANKL Ostéoblaste TRAIL = Facteur pro-apoptotique OPG = facteur de survie des cellules cancéreuses

Body et al, Clin Cancer Res, 2006 UTILISATION EN TH2RAPETIQUE HUMAINE D’UN ANTICORPS DIRIGE CONTRE LE RANKL (DENOSUMAB, AMGEN) Pamidronate Pamidronate Effet du denosumab dans une population de femmes atteintes de métastases osseuses (A; n = 29) et dans une population de sujets présentant un myélome avec une ostéolyse (B; n = 25) sur un marqueur de résorption osseuse (NTX). Body et al, Clin Cancer Res, 2006