Etude histologique, cellulaire et moléculaire de la régénération

colonnes 1 2 3 4

Elucidation du protocole Correction Elucidation du protocole cellule normale cellule musculaire différenciée gène Msx1 protéine Msx1 cellules C2C12 (avec ou sans Flag) Ac anti-Msx1 Ac anti-Flag Flag-Msx1 gène Flag

avant IP : colonne 1 (cellules exprimant seulement Msx1) : protéines présentes dans le noyau = histone H1, histone H3, Pol II, Msx1 colonne 2 (cellules exprimant Flag-Msx1) : mêmes protéines + Flag après IP : colonne 3 : aucun spot car immunoprécipitation des seules protéines Flag-Msx1 colonne 4 : Anti-H1 : présence d’un spot = détection de H1 par les Ac anti-H1 H1 Flag-Msx1 Ac anti-H1

Anti-H3 : absence de spot = absence de détection de H3 par les Ac anti-H3 (marquage de H3 seulement si liaison à Msx1) Anti-Pol II : absence de spot = absence de détection de Pol II par les Ac anti-Pol II Anti-Flag et Anti-Msx1 : présence de spots = détection normale de Flag-Msx1 par les Ac anti-Flag et les Ac anti-Msx1  Msx1 se lie seulement à la protéine histone H1 mais ni à la protéine histone H3 ni à la Pol II : la liaison entre Msx1 et H1 semble H3 libre Flag-Msx1 Ac anti-H3 (mis en présence de Flag-Msx1 exclusivement) spécifique

suivant :

Correction Msx1 entière (contrôle) ou avec délétions 1-42, 1-73 ou 1-104 : résultats identiques = pas d’effets des délétions situées en amont de l’acide aminé 105 sur la liaison de Msx1 sur l’ADN délétion 1-138 : suppression de la répression transcriptionnelle de MyoD, de l’inhibition de la différenciation, de l’interaction avec H1 et de la liaison au CER  région 105-139 nécessaire au rôle de Msx1 et à tous ses effets cellulaires = nécessité de l’intégrité de la région 105-139 délétion de l’homéodomaine et la partie en aval de celui-ci : effets identiques à la délétion 1-138 malgré le maintien de la région essentielle 105-139  la région 105-139 est nécessaire mais pas suffisante pour permettre à Msx1 d’assurer son rôle

 2 domaines de Msx1 sont nécessaires à la liaison de Msx1 à l’ADN : Msx1-A (séquence des acides aminés de l’homéodomaine modifiée) : suppression de la répression transcriptionnelle de MyoD, de l’inhibition de la différenciation et de la liaison au CER mais maintien de l’interaction avec H1  interaction entre Msx1 et H1 nécessaire mais pas suffisante pour la liaison au CER, la répression transcriptionnelle de MyoD et l’inhibition de la différenciation  2 domaines de Msx1 sont nécessaires à la liaison de Msx1 à l’ADN : la région 105-139 qui permet la liaison au CER l’homéodomaine qui lie l’ADN grâce à l’histone H1

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Correction document A, pré-requis : l’histone H1 est nécessaire à l’inhibition de la différenciation des cellules musculaires colonnes 3 et 6 : l’ARNi H1 inhibe l’expression de H1 de 50% ; la diminution de la quantité de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation des cellules musculaires colonne 6 : la coexpression de Msx1 et de l’ARNi H1 entraîne une réduction de la production de H1 et donc une réduction de l’inhibition de la différenciation des cellules musculaires alors que… colonne 5 : … la coexpression de Msx1 et de l’ARNi contrôle ne conduit à aucune diminution de la production de H1, ce qui permet la normale différenciation des cellules musculaires…

… ainsi, l’ARNi contrôle n’interfère en rien dans les mécanismes de contrôle de la différenciation des cellules musculaires  Msx1 nécessite la présence de l’histone H1 pour inhiber la différenciation des cellules musculaires

document B, pré-requis : MHC, chaîne lourde de la myosine, est un marqueur de la différenciation colonne 3, construction Flag-Msx1 : absence de MHC = absence de différenciation (vérification du rôle inhibiteur de Msx1 sur la différenciation des cellules musculaires) colonne 5, construction ARNi H1 : présence de MHC = différenciation cellulaire  l’absence (ou la diminution de quantité) de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation cellulaire colonne 6, construction Flag-Msx1 + ARNi contrôle : absence de MHC = absence de différenciation cellulaire  Msx inhibe la différenciation car… colonne 4, … construction ARNi contrôle : présence de MHC = différenciation cellulaire  pas d’effet propre de l’ARNi

colonne 7, construction Flag-Msx1 + ARNi H1 : présence de MHC = différenciation cellulaire  la suppression (ou la diminution de la quantité) de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation des cellules musculaires  Msx1 nécessite la présence de l’histone H1 pour inhiber la différenciation des cellules musculaires