UE d’Hématopoïèse Les antagonistes du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) amplifient l’accroissement des cellules hématopoïétiques humaines Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Hématopoïèse Introduction Résultats expérimentaux Mécanisme d’action et voie AhR Conclusion Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Introduction But: améliorer les transplants de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Actuellement très utilisés ; mais problème de compatibilité HLA pour les allogreffes. Alternative: sang de cordon, mais souvent nombre d’unités/cordon relativement faible (NB: on peut cumuler deux sangs de cordon pour avoir une greffe acceptable) A l’instar de l’insuline pour les diabétiques, il serait cependant intéressant de pouvoir les produire in vivo, et les synthétiser in fine ex vivo. Problème: trouver un milieu de culture adapté. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Introduction - rappel Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo Différents types de greffe: Allogreffe: donneur ≠ receveur, mais HLA-compatible Autogreffe: cellules mises en banque pour être réutilisées par le donneur Provenance des CSHs: Cellules souches de sang périphérique (Cytaphérèse) Sang de cordon Moelle osseuse Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Introduction - cultures Ex-vivo, les cultures « traditionnelles » (sérum libre, thrombopoïétine, Stem Cell Factor, Flt3-Ligand et IL-6), efficientes in vivo, donnent bien une prolifération-différenciation ici, mais durant cette dernière les cellules perdent leurs antigènes spécifiques de surface… (CD34 et CD133) Une équipe a donc passé au crible plus de 100.000 molécules susceptibles de proliférer-se différencier tout en conservant les marqueurs cellulaires (cellules CD34+ et CD133+)… Parmi elles, SR-1 semble la plus prometteuse. CSH CD133 CD34 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Résultats expérimentaux SR1 Identification Structure A long terme et effet dose Cellules de cordon Réversibilité ≠ animaux et effet antiprolifératif Total des cellules nucléées Rôle sur la division Lignées Greffe Organes (répartition) Double greffe Remarque préalable : le DMSO est un simple solvant, utilisé comme témoin. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 – identification Expression de CD34 et de CD133 en culture en microscopie confocale Hoechst: colore noyaux. Dans la culture contrôle, les cellules perdent leurs marqueurs ■ SR1 ● DMSO Dans la culture SR1: Les cellules prolifèrent Les CD34 et 133 persistent Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 - structure Stemregenin – 1 (SR1) Hétérocycle dérivé purique substitué en 2, 6 et 9 2 6 9 Analogue moins puissant Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 A long terme: Effet dose: J7 J21 => L’expression des protéines perdure CD34+ CD133+ x 2,6 x 2,3 Effet dose: CD34+ Cell totales x 73 x 100 => L’efficacité de SR1 est dose-dépendante Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 – cellules de cordon Mise en culture de 1000 cellules (souches ou progéniteurs) dérivés du sang de cordon Résultats après 21 jours, en cytométrie en flux Fold = [SR1]1µM /[DMSO] Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 - réversibilité Après lavage, et remise en culture sans SR1, l’expression de CD34 chute et rejoint celle de DMSO ■ SR1 ● DMSO => L’effet de SR1 est réversible Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1: ≠ animaux et dose max 14 jours de culture /!\ Représentation des doses à échelle logarithmique ■ Cynomolgus ● Rhésus ▲ Chien Dose maximale efficace pour [SR1] = 1 µM Effet antiprolifératif si [SR1] > 1 µM Aucun effet sur ¢ murines (souris) Uniquement ¢ humaines, simiennes et canines Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 - TNCs Culture de 1000 cellules CD34+ de sang de cordon, en SR1 (noir) ou contrôle (blanc). Le total de cellules nucléées augmente de façon très importante. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1: division symétrique? Utilisation du CFSE, colorant fluorescent marquant les divisions cellulaires SR1 DMSO Mais très bonne conservation des CD34+!! SR1 ≈ DMSO => Pas de rôle dans la division… Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 - lignées Augmentation du nombre de néocolonies (CFUs): Simple myéloïde Simple érythroïde Bipotentiel granulocyte/monocyte Multilignée granulocytaire-érythrocytaire-monocytaire-mégacariocytaire.. avec SR1 seul!! => Soit un accroissement des progéniteurs multipotants précoces Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1: greffe A Mise en culture de 250.000 ¢ CD34+ de sang de cordon pendant 3 semaines Greffe de 300 ou 10.000 ¢ sur souris NOD-SCID (immunodéprimées) Sang après 8 semaines Moelle osseuse 13 semaines => A partir d’un nombre restreint de ¢, la greffe prend de manière précoce et soutenue avec SR1 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 – organes La répartition par organe (Moelle osseuse, rate, thymus) est sensiblement équivalente, SR1 ou non. Au dessus: sans SR1 En dessous: avec SR1 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1: double greffe A B Greffe primaire A Greffe secondaire B SRC (NOD-SCID Repopulating Cells) : cellules humaines capables de reconstitution hématopoïétique = cellules humaines viables après greffe chez la souris Transplantation d’une fraction de la culture finale précédente Les SRC en culture avec SR1 supportent jusqu’à 7 nouvelles transplantations indépendantes !! Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1: mécanisme d’action Confrontation de SR1 et de 61 protéines kinases (effecteurs): aucune activité inhibitrice significative trouvée… => Pas de rôle direct En revanche… Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1: mécanisme d’action En comparant SR1 avec son analogue LGC006, 2 gènes-cibles apparaissent très réprimés par l’un et non par l’autre. SR1 LGC006 CYP1B1 AHRR Ces deux gènes sont régulés via un mécanisme de signalisation complexe basé sur AhR… Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

AhR Récepteur de nature phosphoprotéique. Possède un domaine PAS + structure hélice/boucle/hélice (sans doigt de zinc), et un domaine riche en glutamine pour se lier à l’ADN Absence de ligand: AHR quiescent dans le cytosol, complexé à 2 HSP90 masquant HBH et PAS Présence de ligands exogènes => phosphorylé par la pkC/Tyr, détache HSPs, forme un hétérodimère avec Arnt (AHR nuclear translocator) => noyau => gènes => domaines XRE (en 5’ des cytochromes P450: leurs substrats = ligands de AhR! Ex: TCDD, une dioxine) Théoriquement bon: détoxifie. En pratique: produits de la détoxification à effets cancérigènes… Répresseur compétitif : Protéine AHRR (AHR-repressor) localisé dans le noyau interagissant avec Arnt. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

AhR-CYP450 L HSP90 Arnt Bloqué ici si SR1 Ligand AhR Gène -> ARN -> protéine cytochrome P450 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

AhR-AhRR L HSP90 Arnt Ligand AhR Gène-ARN-protéine répresseur AHRR Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 – antagoniste d’AhR La luciférase sert de gène rapporteur: C’est une enzyme trouvée chez la luciole, dont l’activité émet de la lumière. En insérant l’ADN codant pour cette enzyme à côté du gène qui nous intéresse, on en fait un gène rapporteur permettant de quantifier l’activité du gène-cible. ● SR1 ■ DMSO Avec SR1, le taux de transcription des gènes-cibles d’AhR s’effondre!! => Activité antagoniste d’AhR par action/gènes cibles Spécificité humaine SR1 n’a que très peu d’effet chez la souris, mais est très efficace pour inhiber chez l’Homme Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

SR1 – inhibition directe Prouver le rôle direct de SR1 sur les récepteurs nucléaires d’AhR Le domaine PAS a une phylogénie très particulière: chez les animaux inférieurs, sa seule fonction est la régulation circadienne (cycles jours/nuits). Ce rôle existe encore chez l’Homme et peut être mis à profit… On met en présence : PAL (le ligand à photoaffinité pouvant se fixer sur PAS) Indirubine, dont la fixation à PAL est connue SR1 (fixation à démontrer) LGC006 (l’analogue moins puissant de SR1) La chromatographie, confirmée par la courbe, révèle que contrairement à LGC006, SR1 s’est lié à tous les PAL (qui n’apparaissent plus) de façon équivalente à l’indirubine. => Par analogie, SR1 fonctionne bien par fixation directe sur PAS Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Rôle d’AhR sur l’induction de SR1 Il reste encore à expliquer de quelle façon AhR est lié avec l’hématopoïèse. Des cellules de cordon CD34+ ont été infectées avec des lentivirus (rétrovirus) exprimant : la protéine fluorescente verte GFP (permettant de les voir..) shRNAs ciblant et inactivant AHR Dans les cellules CD34+GFP+, shRNA conduit à la diminution de l’ARNm d’AHR et de son expression protéique, et conserve CD34 pendant la culture. = > l’inactivation d’AhR a des effets similaires à SR1 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

AhR KD Mais, les effets de SR1 nécessitent ils l’inactivation d’AhR? Une version d’AhR privée (Knock-Down) du domaine de fixation pour le ligand a été créé, baptisée CA-AhR.. SR1 ne réussit plus à inhiber l’activité de la luciférase (qui permettait de contrôler l’expression des gènes cibles), et n’a plus aucun effet sur les cellules CD34+ de sang de cordon!! => Cela prouve bien qu’SR1 nécessite une fixation à AhR (en l’occurrence celle du ligand), et qu’il augmente le taux de CD34+ des cellules de cordon. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Conclusion La présence d’AhR a été démontrée dans les cellules hématopoïétiques. Son rôle de facteur de transcription activé par un ligand et induisant des enzymes métabolisant des drogues a pu être ici redémontré Mais AhR est aussi impliqué dans des voies de régulations de l’hématopoïèse: HES1 c-MYC C/EBP PU.1 β-caténine CXCR4 STAT5 Un traitement TCDD (dioxine) des souris donneuses entraîne une diminution de l’activité de reconstitution du pool des cellules Lin-cKit+Sca-1+ (= cellules souches) Reste encore à définir les mécanismes impliqués dans ces processus. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Conclusion SR1 augmente le nombre des cellules souches SR1 et les KD AhR maintiennent l’expression de CD34 SR1 permet la formation de nouvelles colonies multilignée AHR empêche les cellules souches de prendre en greffe en les empêchant de se différencier. Cependant, il n’est pas encore possible d’exclure l’existence de mécanismes alternatifs: il faudrait de meilleurs marqueurs spécifiques des cellules souches humaines, ainsi que des études cliniques. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Ouverture Des études complémentaires à celle-ci avaient été réalisées par la même équipe, essayant soit d’améliorer l’accroissement des cellules souches (angiopoïétine, gènes HOX, chélateurs du cuivre…), soit leur capacité de « Homing » (Prostaglandine E2, fucosylation…) Cette étude-ci permettra, après avoir exploré le potentiel clinique de SR1, d’améliorer le rendement des transplantations et trouver d’autres applications des transplantations autologues ou allogéniques. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

Bibliographie http://www.academie-veterinaire-defrance.org/bulletin/pdf/2003Numero3/37.pdf http://www.ssents.uvsq.fr/spip.php?article42 http://molpharm.aspetjournals.org/content/69/1/140 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas