Autoconservation des gamètes Benoît Schubert Biologie de la Reproduction Pr Catherine Poirot Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière

AUTOCONSERVATION Gamètes matures Tissus gonadiques Spermatozoïdes Ovocytes Tissus gonadiques Ovaire Testicule

Préserver la fertilité chez l’homme

Historique 1776 - Spallanzani 1940 - Cryoprotecteur/ glycérol 1953 - Grossesse avec sperme congelé 1973 - CECOS en France (G. David) et - Centres d’AMP intra conjugale

Techniques Milieux de congélation Mise en paillettes Extrémités soudés Glycérol Agent cryoprotecteur pénétrant Toxique pour la cellule  Contact à basse température  Durée de contact limitée  Ajout en 4 étapes (moins délétère qu’en 1 fois) Mise en paillettes Extrémités soudés

Techniques Congélation Décongélation cristallisation de l’eau extra-cellulaire Concentration relative des solutés augmente Déshydratation du spermatozoïde Décongélation Retrait du CP en plusieurs étapes Concentration relative des solutés diminue (milieu hypo-osmotique) Entrée d’eau dans le spermatozoïde Puis sortie du Glycérol Retour à un volume cellulaire normal

Techniques Congélation ‘lente’: en azote liquide Décongélation rapide manuelle Vapeurs d’azote : 8-30 minutes Plonge dans azote liquide Appareils programmables Descente en température contrôlée 5°C/minute  - 10°C 10°C/minute  - 25°C 25°C/minute  - 150°C Décongélation rapide -196°C  37°C (en qq minutes)

Effets de la congélation sur les spermatozoïdes Mobilité :  variable, environ 50% Vitalité :  variable, environ 50% Membrane : Gonflements Membrane plasmique Gonflement acrosome  perte acrosome Modification de la composition phospholipidique Noyau Chromosomes: pas de modification nb, structure, sex ratio Etat de sur-condensation de la chromatine

INDICATIONS PREVENTION AMP TRAITEMENTS A RISQUES Chirurgie à risque Pathologies à risque Vasectomie Dégradation caract. spermatiques Situation à risque … Cryptozoospermie Spz chirurgicaux Spz médicaux Spz après chirurgie Spz contexte viral … L’autoconservation doit être « systématiquement proposée » avant une « thérapeutique ou intervention potentiellement stérilisante » Et peut être proposée « avant ou au cours d’une AMP » Arrêté du 12/1/1999

FEDERATION DES CECOS : 30 ans d’autoconservation Avant Traitement (27182) Avant vasectomie (7904) AMP (9618) Spz chirurgicaux (2662)

FEDERATION DES CECOS : autoconservation maladie

Pourcentage d’hommes pour lequel la congélation a pu être réalisée % Avant vasectomie 97% 91% 92% Avant traitement 65%

Patient Information autoconservation Accueil du patient personnalisé Consultation avec médecin biologiste Méthodes Masturbation Recherche spermatozoïdes dans les urines Urgence du traitement : permanence de l’accueil Information des résultats de la congélation « Le patient doit être informé de la qualité du sperme et du nombre de paillettes » Arrêté du 12/1/1999

Techniques : rares spermatozoïdes Mise en paillettes classiques ‘haute sécurité’ Micro-gouttes Guthauser et al., Andrologie 2002 SPZ  Intérêts : augmenter le nombre de « doses », faciliter la recherche des spermatozoïdes prêts à l’emploi

Sécurité Patient Générale Identité Traçabilité Consentement Interrogation annuelle ‘Renouvelable sur demande écrite’ Utilisation Résultats Destruction « Seul le déposant peut demander la restitution ou la destruction » Sérologies HIV, VHB, VHC, Syphilis Paillette ‘haute sécurité’ Cuve de quarantaine Cuves spécifiques Accès locaux Sécurité azote

Problèmes Age Maladie de l’homme Indications autres Limites supérieures Limites inférieures Puberté, possibilités de masturbation Maladie de l’homme Urgence Etat du patient Indications autres Vasectomies Professions Sportifs Information Patients et médecins

Perspectives Optimisation des méthodes de congélation Tissu gonadiques Meilleure information sur l’autoconservation …. Lyophilisation du spermatozoïde !!! Wakayama T. Yanagimachi R., Nature Biotechnology 1998

Préserver la fertilité chez le garçon prépubère

Introduction Enfant : préservation de la fertilité A partir de 13-14 ans : spermatozoïdes Avant 13-14 ans Pas de spermatozoïdes éjaculés Cellules souches germinales mâles : spermatogonies Testicule Spermatogonies Pool de réserve : régénération  spermatozoïdes : à partir de la puberté Préserver la fertilité : spermatogonies

Stratégie de Préservation de la Fertilité des garçons prépubères Avant le début du traitement stérilisant Prélèvement de spermatogonies Conservation spermatogonies : congélation Après guérison Greffe Culture Xénogreffe ? Recherche 20

Préserver la fertilité des garçons : Espoirs Geens et al., 2008 21

Questions Quel volume de tissu à prélever ? Quel tissu conserver ? Un testicule entier Fragments de testicule Quel tissu conserver ? Fragments de tissu Suspension cellulaire Quel protocole de congélation ? 22

Questions Contamination cellules malignes Contenu en spermatogonies Tri cellules malignes/testiculaires  0,4% cellules malignes Seuil inconnu chez l’homme Contenu en spermatogonies Faible : 3/10 000 cellules germinales (souris) Enrichissement ? Effets des traitements sur le testicule 23

Utilisation Tissu FRAIS : Allogreffe Résultats chez la souris Injection spermatogonies dans tubules séminifères, rete testis, canaux efférents, … Production de spermatozoïdes Chez différentes espèces dont primates Résultats chez la souris Naissances Xénogreffe Tissu humain prépubère frais  souris nude (s/c) 4 et 9 mois après greffe : « qq spermatogonies survivantes » (Goossens et al., 2008) 24

Utilisation Tissu CONGELE Culture Survie cellulaire (souris, lapin, humain, …) Xénogreffe sous cutané production de spz (souris) Survie spermatogonies (humain) Culture Souris Multiplication des spermatogonies obtention de spermatozoïdes Peu de résultats dans d’autres espèces 25

Autoconservations Spermatogonies Radford et al., 1999 : 11 hommes Bahadur et al., 2000 : 2 garçons (8 et 13 ans) Keros et al., 2005 : 16 hommes Kvist et al., 2006 : 8 garçons (1 à 5 ans 1/2) Keros et al., 2007 : 5 garçons (2 à 14 ans) France : 3 centres (+ 20 patients) 26

En pratique Préservation de la fertilité chez jeune garçon Conservation de cellules souches spermatogonies Utilisation A déterminer Dans 20 ans TTT potentiellement stérilisant, amélioration de la survie, la question de la qualité de la vie après le cancer est soulevée et la PF en est une part importante 27

En pratique Indications Technique expérimentale Multidisciplinarité Consentements (parents) Technique expérimentale 28

Préserver la fertilité chez la femme

Mise en péril du stock folliculaire Stock de follicules : Pas de renouvellement 6.106 (intra-utérin)  1.106 (naissance)  0,5.106 (puberté)  …… 99% des follicules : atrésie Temps Chimiothérapie (Alkylants+++) / Radiothérapie Greffe médullaire : chimio+radio  ménopause 92% des cas (Meirow et al., 2001) Pathologies malignes : Femmes : K sein, K invasifs du col, leucémies, … Enfance : leucémie, neurob., LH, ostéosarc., sarc.d'Ewing, LNH Ovariectomie totale ou partielle : Endométriose, kystes bénins récurrents, tumeur Ménopause précoce prévisible : X (Turner, délétion, inversion), génétiques, …

Préserver la fertilité féminine aujourd'hui Sans gamètes de la patiente : Don ovocytes Accueil d'embryons Adoption Avec gamètes de la patiente : Transposition ovarienne Traitement aux analogues du GnRH Congélation d'ovocytes : matures ou immatures FIV  embryons, congelés  transférés après guérison Cryoconservation du tissu ovarien  Combiner plusieurs solutions

CONGELATION D’OVOCYTES

Congélation d’ovocytes Stimulation de l’ovulation : temps, traitement hormonal Pas de conjoint pas de désir d’enfants immédiat Ovocyte : cellule particulière, différente de l’embryon volumineux cytoplasme membrane plasmique protocole de congélation particulier Congélation lente Vitrification Effets de la congélation/décongélation: Dégranulation prématurée des granules corticaux  durcissement de la Z.P. Dépolymérisation du réseau de tubuline du fuseau méiotique et repolymérisation  aneuploidies, polyploidies ? Incubation de quelques heures pour permettre repolymérisation

Congélation d’ovocytes Résultats Congélation lente 1ère grossesse : Chen et al., 1986 532 enfants nés (1986-2008) Implantation/100ovocytes décongelés : 2,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 2,3-2,2 (Oktay et al., 2006;2008) Vitrification 392 enfants nés (1986-2008) Implantation/100ovocytes décongelés : 6,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 4,5-5,8 (Oktay et al., 2006;2008) Technique prometteuse en évaluation Gook et Edgar, 2007

LA FECONDATION IN VITRO

La F.I.V. Stimulation de l’ovulation Conjoint Temps Traitement hormonal Conjoint Désir d’enfants précipité ?

LA CRYOCONSERVATION DE TISSU OVARIEN

La cryoconservation du tissu ovarien Pas de stimulation de l’ovulation Pas de conjoint Désir d’enfants différé Femme < 35 ans Enfant Prélèvement per coelioscopique : Selon le risque estimé de castration : 1 ovaire entier ou ½ ovaire Transport au laboratoire dans l’heure

La cryoconservation du tissu ovarien Garde cortex ovarien uniquement: réserve folliculaire 1-2 mm épaisseur Médullaire ôtée Découpe en bandelettes (5 x 10 mm) Conservation : Milieu cryoprotecteur (PROH, sucrose, …) Cryotubes Descente en température contrôlée  -196°C

Utilisation du tissu ovarien congelé Seuls les follicules primordiaux et primaires résistent à la congélation Maturation : GREFFE Autogreffe : Orthotopique, pelvienne : restauration de la fertilité naturelle Hétérotopique : sous cutané, intra-musculaire , … : FIV Xénogreffe : Souris immunodéprimées (nude, SCID, …) CULTURE IN VITRO COMBINAISON greffe/culture in vitro ?

Greffe de tissu ovarien congelé/décongelé Autogreffe : Avantages "Simple" de réalisation Revascularisation ‘spontanée’ Succès chez animal et l’humain Inconvénients : Risque de transmission de cellules cancéreuses Destruction folliculaire Congélation/décongélation (survie 10 à 70%) Ischémie post greffe (+++)

Résultats 5 naissances rapportées à ce jour Donnez et al., 2004 Meirow et al., 2005 Demeestere et al., 2007 Andersen et al., 2008 Silber et al., 2008 September 24, 2004

Culture in vitro Avantages : Techniques : plusieurs étapes Zone pellucide : exclue toute cellule, métastatique Techniques : plusieurs étapes Fragments de cortex ovarien : initiation de croissance ( follicule préantral) Isole le follicule du cortex ( follicule antral) Isole l'ovocyte ‘immature’ (follicule > 2 mm)  maturation finale

Culture in vitro Résultats : Follicule primordial  ovocyte mature : Une espèce : Souris Eppig and O'Brien, 1996 : 1 souris vivante décès prématuré troubles neurologiques et hépatiques, obésité O’Brien et al., 2003 : 48 souriceaux vivants en bonne santé Femme : Follicule primordial  secondaire (2 semaines !) Follicule secondaire  antral Follicule antral  ovocyte mature fécondable Maturation in vitro : 1ère naissance : Veeck et al., 1983 Association xénogreffe puis culture in vitro ?

Histological sections of in vitro grown human follicles cultured first in cortical strips for 6 days (Step 1) then subsequently isolated at the pre-antral stage and cultured for a further 4 days (step 2) in the presence (A and B) or absence (C and D) of 100 ng/ml of activin A. TISSU FRAIS Telfer, E. E. et al. Hum. Reprod. 2008 23:1151-1158; doi:10.1093/humrep/den070 Copyright restrictions may apply.

Préserver la fertilité féminine ? BALANCE: Altération de la fertilité par le traitement Altération de la fertilité par le prélèvement d’ovaire (ovariectomie unilatérale ne divise pas le stock par deux) Conjoint ? Désir d’enfants ? Associer les différentes techniques Congélation cortex ovarien Congélation ovocytes immatures (follicules antraux) Enfant : information aux parents