Différenciation endothéliale et processus angiogéniques Université de Reims Champagne Ardenne CHU de Reims EA3801 Différenciation endothéliale et processus angiogéniques Pr Philippe NGUYEN EA3801 et Laboratoire d’Hématologie

- Corps de Weibel Palade (ME) Cellule endothéliale 1 à 6 10 13 cellules Poids total : 1 kg Surface : 1 à 7 m2 - Corps de Weibel Palade (ME) - Facteur Willebrand - PECAM1 (CD31) / VE-Cadhérine (CD144) - Synthèse de NO (eNOS) - JAMS/Esélectine/VEGFR2 Cellules aplaties (L:100 µm-l:10 µm Épaisseur :0,3 µm) disposées en mosaïque

Angiogénèse ANGIOGENESE POST-EMBRYONNAIRE, NON TUMORALE : angiogénèse : prolifération capillaire, favorisant le flux sanguin vasculogénèse : à partir de progéniteurs endothéliaux artériogénèse : développement des réseaux collatéraux (résistance) Différenciation Migration / Prolifération Hypoxie Facteurs de croissance/Cytokines HIF-1a VEGF, FGF, IGF…

Cellule progénitrice endothélial :  endothelial progenitor cell (PEC) Différenciation et acquisition d’un phénotype endothélial à partir d’une cellule souche hématopoïétique CD34+ [Asahara, 1997] Circulating bone marrow-derived endothelium progenitor cells (CEPCs) [Rafii, 1998] : CD34+ Marqueurs phénotypiques : facteur von Willebrand, Dil-Ac-LDL.

Isolement des cellules CD34+ Sang de cordon 1. Isolement des PBMC 2. Élimination des cellules adhérentes 3.Tri immuno-magnétique des cellules CD34 positives 4.Mise en culture dans des « conditions endothéliales » (VEGF …) 

Facteurs de croissance (VEGF…) Modèle de différentiation des cellules CD34+ en progéniteurs endothéliaux (PEC) J0 J25-30 Facteurs de croissance (VEGF…) Cellule souche CD34+ Progéniteurs endothéliaux Analyse de l’expression membranaire et moléculaire à différent temps de la différenciation: VEGF, VEGFR1,VEGFR2,CD144(VE-cadhérine), et FT

Caractérisation des PEC Culture cellulaire À partir de sang de cordon, de sang périphérique Support : gélatine, fibronectine, collagène de type I Facteurs de croissance : VEGF, IGF-1, EGF, FGF-B Temps d’obtention Aspect des colonies : Cellules adhérentes « spindle shaped » Tapis de cellules fusiformes précoces tardives

Phénotype des PEC CD133 (AC133) : Exprimé par la CSH Absent de la cellule endothéliale mature et du monocyte Différenciation endothéliale in vitro CD34 : marqueur de cellule souche hématopoïétique Présent (faible expression) sur la cellule endothéliale mature VEGF-R2 (KDR) : Marqueur endothélial

Phénotypage des PEC par cytométrie en flux VEGFR2 EPC HUVEC CD34 Count CD34 : PBMC de sang de cordon PEC : en milieu de culture adapté HUVEC : Cellules endothéliales matures EA3801

Origine (multiple) des précurseurs endothéliaux Hémangioblaste HSC Progéniteurs Myéloïdes Progéniteurs Endothéliaux Monocyte

Progéniteurs endothéliaux circulants CD14+ CD34+ Monocyte PEC PEC CD14+,CD34low, KDR+ CD34+, CD133+, KDR+ Sous-type myéloïde « True angioblast » Leri, Circ Res 2005

Origine et différenciation des progéniteurs endothéliaux, d’après Dimmeler, 2004.

Caractérisation des PEC X 40 Mesure de la prolifération Expansion Migration cellulaire Formation de tubes : (Matrigel) Activité paracrine : synthèse de facteurs de croissance : VEGF, HGF, G-CSF, GM-CSF Modèles animaux : Implant de Matrigel Modèle d’ischémie de la patte (ligature de l’artère fémorale) Rehman, 2003 ; Hur, 2004

Sources possibles de cellules endothéliales Cellules souches : CSH, cellules souches « cardiaques », cellules souches mésenchymateuses, Cellules myéloïdes : CD14+/VEGF-R2+ CD34-/CD133- : Acquisition de marqueurs endothéliaux phénotypiques Formation de tubes in vitro Cellules endothéliales matures : shedding vasculaire

Mobilisation des « PEC » Moelle osseuse Cellules stromales médullaires MMP-9 mKitL cKit+ Hémangioblaste sKitL Barrière endothéliale Sang Précurseur hématopoïétique circulants PEC circulants D’après Hristov, 2003

Mobilisation des PEC Micro-environnement, « niches » : Protéinases : Fibroblastes, ostéoblastes, cellules endothéliales Protéinases : Élastase, cathepsine G, métalloprotéinases matricielles (MMP) Clivage de mkitL (kit ligand membranaire) par MMP-9 Facteurs de croissance G-CSF, GM-CSF, EPO SDF-1, VEGF, angiopoïétine

Processus de réparation endothéliale par les PEC Cellule endothéliale Circulante (CEC) CD146 + CD31 + PEC vWF+ intégration CE Matrice extracellulaire CML Transdifférenciation D’après Hristov, 2003

Comparaison CEC versus PEC Cellule mature, provenant de la paroi vasculaire Témoin d’une lésion vasculaire Expression de marqueurs endothéliaux : CD146, vWF, CD31… Pas d’expression des marqueurs CD45/CD133 Pas de potentiel clonogénique Progéniteur Témoin d’une lésion vasculaire ? D’une régénération ? Faible expression de CD146, CD31 Faible expression de CD45, expression de CD133 Potentiel clonogénique 20 cellules/mL

Dimmeler, 2004

Différents phénotypes endothéliaux Cellule « tip » Leader Filopodes étendus Signaux de direction Migration à travers la matrice extracellulaire Cellule « stalk » Prolifération Vacuoles créant la lumière vasculaire Produit la matrice Cellule « phalanx » Devient quiescent Monocouche Jonctions serrées Contact avec le péricyte

Induction et déstabilisation de la paroi capillaire Induction par hypoxie HIF : complexe hétérodimérique sensible à l’hypoxie En hypoxie : dimérisation et activation des gènes cibles (HRE : promoteurs) Déstabilisation de la paroi capillaire : sortie de la quiescence endothéliale NO libéré lors de l’hypoxie : favorise la perméabilité induite par le VEGF VEGF : VEGF-R2 : activité tyrosine kinase (MAPK/PI3K) Angiopoiétines

Facteurs de croissance angiogéniques VEGF Effet via les récepteurs VEGF-R1 (flt-1) et VEGF-R2 (flk/KDR) : activité tyrosine kinase Favorise la migration et la prolifération endothéliale Augmente la perméabilité vasculaire Angiopoïétine-1 Effet via le récepteur Tie2 (tyrosine kinase) Effet sur l’engagement des précurseurs endothéliaux Effet sur la migration endothéliale Pas d’effet sur la prolifération endothéliale Recrutement des péricytes Angiopoïétine-2 Expansion cellulaire b-FGF Anti-apoptotique, activation d’Akt

Inhibiteurs de l’angiogénèse Angiostatine 38 kDa, 3 kringles Générée par protéolyse du plasminogène par métallo-élastases et MMP Induit l’apoptose des cellules endothéliales Inhibe la prolifération endothéliale Endostatine 20kDa, fragment du collagène XVIII (cathépsine L, élastase) Inhibition de la migration endothéliale (dépendant de eNOS) Pro-apoptotique (réduction de Bcl-2, Bcl-XL) Thrombospondine-1 Glycoprotéine haut poids moléculaire Ligand de CD36 Pro-apoptotique (p38-MAPK : activation des caspases)

Progéniteurs de la cellule endothéliale Source Procédé d’isolement Marqueurs cellulaires Moelle osseuse Microbilles CD133+ CD146-, CD133+, CD31-, vWF-,VE-cadhérine - Sang de cordon Microbilles CD34+ CD133+ Sang périphérique Adhésion PBMC CD133+ ou CD133- CD146 : marqueur de la cellule endothéliale circulante

Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire EA 3801

Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire EA 3801