Centre Léon Bérard INSERM / UCBL U590 Jeudi 10 décembre 2009 Les gènes TWIST : cibles transcriptionnelles des gènes MYC dans le neuroblastome Soutenance de thèse Abdelkader Selmi Directrice de thèse : Dr Sandrine Wittmann Directeur dunité : Pr Alain Puisieux

2 Sommaire Introduction –Cancers embryonnaires : neuroblastome –Gènes MYC & TWIST MYC & TWIST dans le neuroblastome MYC & TWIST : modèle de progression tumorale Conclusion & Perspectives

3 INTRODUCTION

4 Cancer Théorie mutationnelle (Elenbaas et al., 2001; Loeb et al., 2003) –Oncogènes –Suppresseurs de tumeurs Théorie instabilité génétique (Weaver et al., 2007; Li et al., 2005) Théorie de la cellule souche cancéreuse (Pardal et al., 2003) Gènes du développement Cancers embryonnaires –neuroblastome, glioblastome Introduction Cellules tumorales Cellule souche normale Cellule différenciée Cellule Souche Cancéreuse mutations dédifférenciation Adaptée de Pardal et al., 2003

5 Cancer pédiatrique & cancer adulte Maris et al., 2002; Pahlman et al., 2004 Introduction

6 Neuroblastome Localisation : –35 % surrénalienne –65 % abdominale Tumeur embryonnaire : enfant très jeune (98% < 2 ans) Hétérogénéité clinique –Régression spontanée –Tumeurs agressives, fatales Reflet dhétérogénéité biologique Cervicale Thoracique Surrénalienne Abdominale Introduction

7 Neuroblastome Neuroblastome dérive des neuroblastes –précurseurs du système nerveux périphérique Cellule de la crête neurale MélanoblasteGlioblasteNeuroblaste Cellule mésenchymateuse Glie Système Nerveux Périphérique & Médullosurrénale Léptoméninges Ectomesenchyme Mélanocyte Thiery, 2002 Introduction

8 Neuroblastome Instabilité mitotique Instabilité génomique 2N Cellule différenciée TYPE 1 Cellule apoptotique TrkA 3N TYPE 2 TYPE 3 1p-,17q+,NMA 2N/4N 1p-, 17q+ 2N/4N TrkB 17q+ 2N 11q-,14q-, 17q+ 2N/4N 5 stades –1 et 2 : localisé –3 : envahissement des ganglions lymphatiques –4 : métastases à distance –4S : métastases, enfant < 1 an 3 types (Brodeur et al., 1997) –Instabilité mitotique –Instabilité génomique 50 % des neuroblastomes : à haut risque –Amplification de N-MYC (NMA) : importance diagnostique Introduction

9 N-MYC & TWIST1 : coopération oncogénique 30% des neuroblastomes : N-MYC Amplifiés Mutation de TP53 : < 5 % des neuroblastomes Surexpression de TWIST1 Tumeur Apoptose Amplification de N-MYC p53 fonctionnelle Surexpression de TWIST1 corrélée à lamplification de N-MYC TWIST1 : inhibiteur fonctionnel de la voie p53 Maestro et al., 1999; Valsesia-Wittmann et al., 2004 Introduction

10 MYC, TWIST & neuroblastome Neuroblastome –Anomalie du développement –Hétérogénéité biologique Implication de deux familles de gènes –MYC : N-MYC (Amplification) et c-MYC (Liu et al., 2008) –TWIST : TWIST1 et TWIST2 « Double-jeu » des gènes du développement –Développement embryonnaire –Dérégulation = cancer Introduction

11 Les gènes MYC Max Myc INR Miz1 Famille : c-MYC, N-MYC et L-MYC Facteurs de transcription à domaine bHLH-LZ Hétérodimérisation : Myc-Max Max Myc boite E CBP/p300 TIP60 TIP48/TIP49 TRRAP GCN5 Activation transcriptionnelleRépression transcriptionnelle Grandori et al., 2000; Adhikary & Eiler, 2005; Cowling & Cole, 2006; Meyer & Penn, 2008 Introduction

12 Les gènes MYC Activation oncogénique : dualité fonctionnelle Coopération oncogénique –BCL-2 : lymphomes (Strasser et al., 1990) Régulation de nombreuses fonctions (Vita & Henriksson et al., 2006) Myc Dérégulation Instabilité génomique Prolifération Angiogenèse Apoptose Croissance cellulaire Transformation tumorale Différenciation Finley et al., 1989; Escot et al., 1993; Nau et al., 1985; Schwab et al., 1983 Introduction Nombreux cancers : colon, sein, poumon, neuroblastome…

13 Les gènes MYC et cellules souches c-MYC : formation des crêtes neurales (Steventon et al., 2005) c-MYC : autorenouvellement –cellules souches embryonnaires murines (Cartwright et al., 2005) c-MYC + OCT4 + SOX2 + KLF4 : dédifférenciation (1) –Cellule Souche Pluripotente induite (iPS) Cellule Souche Pluripotente induite Cellule différenciée c-MYC + OCT4 + SOX2 + KLF4 Reprogrammation N-MYC : prolifération et migration des neuroblastes (Wakamatsu et al., 1997) 1-Okita et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Wernig et al., 2007; Hanna et al., 2008 Introduction

14 Les gènes TWIST Facteurs de transcription Inhibiteurs –Différenciation –Apoptose –Sénescence oncogénique Chimiorésistance Nombreux cancers : sein, prostate, œsophage, gliomes… Boite Twist Domaine riche en Glycine Domaine de liaison à lADN bHLH Twist2 Twist1 54% 95% 100% Homologie Maestro et al., 1999; Ansieau et al., 2008; Watanabee et al., 2004; Kwok et al., 2005; Xie et al., 2009; Elias et al., 2005 Introduction

15 Les gènes TWIST et cellules souches TWIST1 : crête neurale (ORourke & Tam, 2002) TWIST2 : formation du derme (Sosic et al., 2003) EMT Marqueurs épithéliaux E-cadhérine Caténine α, β, γ Cancer in situ Twist1 Twist2 Marqueurs mésenchymaux N-cadhérine, Fibronectine, Vimentine, Smooth muscle actine Cancer invasif Introduction Transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) (Kang & Massagué, 2004; Ansieau et al., 2008)

16 Les gènes TWIST et cellules souches Cellules Souches Mésenchymales (MSC) + TWIST1 ou TWIST2 Maintien des propriétés souches (Isenmann et al., 2009) Introduction Expression de Id1 et Id2 Transition éptihélio-mésenchymateuse Croissance cellulaire et survie Maintien phénotype immature Twist1 Twist2 ou Cellule Souche Mesenchymale

17 Dérégulation et interrelations des gènes MYC & TWIST dans le neuroblastome Développement dun modèle de progression tumorale à partir des gènes MYC & TWIST Quels sont les rôles des gènes MYC & TWIST dans le neuroblastome ?

18 RÉSULTATS

19 ÉTUDE DE LA DÉRÉGULATION DES GÈNES MYC ET TWIST DANS LE NEUROBLASTOME

20 Dérégulation des gènes MYC & TWIST dans les tumeurs de neuroblastome Corrélation N-MYC et TWIST1 dans les N-MYC amplifiées Expression de TWIST1 et de c-MYC dans des tumeurs simple copie pour N-MYC MYC & TWIST – Résultats Collaboration avec le Dr MD Hogarty Texas Children Hospital RT-PCR quantitative

21 Dérégulation des gènes MYC & TWIST dans les tumeurs de neuroblastome 124 échantillons tumoraux Stade12344STotal n = Analyse de lexpression de N-MYC et TWIST1 –RT-PCR quantitative Corrélation entre N-MYC et TWIST1 –Pearson = 0,807 ; p < 2,2x10-16 –Indépendante du stade Les gènes TWIST cibles des gènes MYC ? Linverse ? MYC & TWIST – Résultats Collaboration avec le Dr J Bénard Institut Gustave Roussy

22 Les protéines Myc modulent lexpression des gènes TWIST Ornithine Décarboxylase (ODC) : cible directe des gènes MYC (Bello-Fernandez et al., 1993;Lutz et al., 1996) Les protéines Myc modulent lexpression des gènes TWIST MYC & TWIST – Résultats RT-PCR quantitative Lignée simple copie : SHEP Surexpression ectopique de c-MYC ou N-MYC : 1 ou 2 µg 24h

23 Les gènes TWIST : cibles de la protéine N-Myc Lignée simple copie : TET21N N-MYC sous contrôle dun promoteur « Tet OFF » TWIST1 cible indirecte ? TWIST2 cible directe ? MYC & TWIST – Résultats RT-PCR quantitative N-Myc Twist1 Actine-β T0T2T4T6T8T20T22T24T26T28T30T32T48 Western Blot

24 Inhibition de lexpression de N-MYC Lignée WAC : plasmide de surexpression de N-MYC (100x) ARN interférence : siRNA N-MYC N-MYC réprime lexpression de c-MYC c-MYC : maintien de lexpression de TWIST1 Zindy et al., 2006; Breit et al., 1989 MYC & TWIST – Résultats RT-PCR quantitative

25 Étude du promoteur de TWIST E3 non consensus E2 boite E E1 boite E -93 boite TATA INR TWIST1 Analyse in silico du promoteur de TWIST1 –Boite TATA –Élément INR : liaison de Miz1 –Boites E : E1, E2, E3 et non consensus Fixation des protéines à domaine bHLH : c-MYC, N-MYC… Fixation des protéines Myc au promoteur de TWIST1 ? MYC & TWIST – Résultats

26 Les protéines Myc se fixent sur le promoteur de TWIST1 Fixation des protéines Myc sur lélément INR (indirecte ?) et sur la boite E1 (directe ?) du promoteur de TWIST1 E3E2E1 INR TWIST1 IGRN91 – sonde INRSHEP – sonde INRSK-N-SH – sonde E1 MYC & TWIST – Résultats 1 : contrôle amorces biotinylées seules 2A : Amorces biotinylées + extrait protéique 2B : 2A + Ac anti-N-Myc 2C : 2A + Ac anti-c-Myc 3 : 2A + excès amorces non biotinylées

27 Constructions pGL3 Système reporteur pGL3 enhancer : test dual luciférase Fragments du promoteur de TWIST1 Cotransfection avec c-MYC ou N-MYC Promoteur TWIST E TWIST1 E2 boite E E1 boite E INR non consensus boite TATA 2E-box E2E1 INRluciférase minimum luciférase 1E-boxS 1E-boxAS E3 luciférase MYC & TWIST – Résultats

28 Les protéines Myc activent le promoteur de TWIST1 Mutation dirigée de la boite E3 –1E-boxS mutée et 1E-boxAS mutée Activation de TWIST1 par les protéines Myc via les boites E MYC & TWIST – Résultats Tests luciférase effectués à 24h dans la lignée SHEP minimum 1E-boxAS vide pODC 1E-boxAS mutée 1E-boxS mutée 2E-box 1E-boxS

29 Les gènes TWIST : cibles transcriptionnelles des protéines Myc Corrélation dexpression dans le neuroblastome –N-MYC et TWIST1 : indépendante du stade –c-MYC et TWIST1 : dans certaines tumeurs Simple Copie Pas de corrélation dans les carcinomes : colon et sein –Tumeurs surexprimant TWIST expriment aussi c-MYC Les protéines Myc modulent lexpression des gènes TWIST –Différence entre TWIST1 et TWIST2 –c-MYC : relais de N-MYC MYC & TWIST – Conclusion

30 Les gènes TWIST : cibles transcriptionnelles des protéines Myc Fixation des protéines Myc sur le promoteur de TWIST1 –Directe sur les boites E –Indirecte sur lélément INR via Miz1 Régulation par les protéines Myc –Activation par fixation des boites E –Répression via Miz1 TWIST1 et TWIST2 : cibles transcriptionnelles directes des protéines Myc MYC & TWIST – Conclusion

31 DÉVELOPPEMENT DUN MODÈLE DE PROGRESSION TUMORALE Les gènes MYC et TWIST sont-ils suffisants pour limmortalisation et la transformation tumorale de cellules souches ou progénitrices ? Est-il possible de développer un modèle de progression tumorale à partir de telles cellules ?

32 Neuroblastome : anomalie du développement Pas de modèle détapes précoces Comment définir les rôles exacts des gènes MYC et TWIST au cours du processus tumoral du neuroblastome ? Modèle de progression tumorale Cycle cellulaire Apoptose Effets sur p53, p63 et p73 Réponse aux stress exogènes Chimiorésistance Cellules ADAS – Introduction Cellules tumorales ? c-MYC ou N-MYC et/ou TWIST1 ou TWIST2 Cellules souches ou progénitrices Cellules « normales » : neuroblastes embryonnaires Cellules souches neurales du système nerveux central

33 Modèle de progression tumorale à partir des cellules ADAS Cellules ADAS : cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux –Cellules Souches Mésenchymales (MSC) –Autorenouvellement –Etat de quiescence Pluripotentes (Zangani et al., 1999; Zuk et al., 2002; Safford et al., 2002; Safford et al., 2004; Rodriguez et al., 2005) –Adipocytes, fibroblastes, cellules endothéliales –Ostéoblastes, myoblastes, chondroblastes –Cellules de la glande mammaire –Lignages neuraux Liposuccions : opérations au Centre Léon Bérard Développer un modèle de progression tumoral à partir des cellules ADAS et des gènes MYC & TWIST Cellules ADAS – Introduction Collaboration avec le Dr V Maguer-Satta et le Dr E Delay INSERM U590, Centre Léon Bérard

34 Objectifs Caractérisation phénotypique des cellules –Expression de marqueurs Détermination de la sensibilité/résistance aux traitements (Cisplatine, Etoposide et Vincristine) Dérégulation de lexpression des gènes MYC et TWIST Cellules tumorales ? c-MYC ou N-MYC et/ou TWIST1 ou TWIST2 Cellules ADAS Cellules ADAS – Introduction

35 Extraction et mise en culture Digestion 45min à 37°C sous agitation milieu DMEMF12 + 2% BSA + 0,4 mg/mL de collagénase Lyse des érythrocytes 10min à température ambiante Mise en culture des cellules en suspension Lipides Tissu fibreux non digéré Surnageant éliminé Culot Centrifugation 10min à 300g J0 : jour extraction P0 : avant 1 er passage P1 : après 1 er passage P2 : après 2 ème passage Cellules ADAS – Introduction

36 Caractérisation phénotypique des cellules ADAS Marqueur Moyenne J0 Moyenne P1 GPA1,35- CD13300 CD1010,9923,96 CD2947,27- CD9043,2929,94 CD153,8239 CD7333,4634,56 CD1056,3626,95 J0 : cellules après extraction P1 : après 1 er passage Présence de cellules ADAS dans les cellules extraites Cellules ADAS – Résultats GPA : érythrocytes Cellules ADAS Cellules Souches Mésenchymales CD133 : Cellules souches Cytométrie en flux

37 Caractérisation phénotypique des cellules ADAS Composition des sphères change : différenciation ? Cellules ADAS – Résultats RT-PCR quantitative –BMI1 : autorenouvellement –OCT4 & Nanog : pluripotence –Nestine & PAX3 : cellules neurales –TWIST1 : cellules souches Expression des marqueurs des cellules souches diminue Induction des marqueurs de lengagement neural

38 Différenciation neurale programme par défaut Culture en 2D Différenciation neurale = programme par défaut ? Coloration au Giemsa culture 2D J15Culture 3D Cellules ADAS Sphères dissociées Co-culture sur NIH3T3 irradiées en absence de sérum Culture 3D : Matrigel Cellules ADAS – Résultats Prolongements de types « neurites »

39 Différenciation neurale des cellules ADAS Cellules ADAS Ensemencement sur des lamelles de verre coatées à la poly-L-lysine 10 jours DMEMF12 5% SVF Marquage par Immunofluorescence GFAP Cytoplasmique Astrocytes O4 Cytoplasmique Oligodendrocytes NeuN Protéine nucléolaire Cellules nerveuses Différenciation des cellules ADAS en cellules neurales Cellules ADAS – Résultats Collaboration avec le Dr A Privat Institut des Neurosciences

40 Chimiorésistance des cellules ADAS 24h de traitement : pas de diminution du taux de multiplicité Chimiorésistance intrinsèque des cellules ADAS à P0 Cellules ADAS – Résultats P0 : cellules avant 1 er passage Taux de multiplicité par rapport à linput Tests uptiblue cellules / puits Concentration mol/L

41 Perte de la chimiorésistance Après 2 passages : cellules ADAS sensibles aux drogues Chimiosensibilité : cellules en cours de différenciation ? Cellules ADAS – Résultats P2 : cellules après 2ème passage Taux de multiplicité par rapport à linput Tests uptiblue cellules / puits Concentration mol/L

42 Cellules ADAS Les prélèvements contiennent des cellules ADAS –Expression des marqueurs des cellules ADAS et MSC –Capables de se différencier Ces cellules sont chimiorésistantes à P0 Electroporation des cellules ADAS possible Cellules ADAS – Conclusion Base pour le développement dun modèle de progression tumorale –Activation doncogènes –Inhibition de gènes suppresseurs de tumeurs

43 CONCLUSIONS & PERSPECTIVES

44 MYC & TWIST Conclusions & Perspectives Régulation des gènes TWIST par les facteurs Myc : complexe –Identification de cofacteurs : Miz1… –Boucles de rétrocontrôle TWIST vers MYC, TWIST1/TWIST2 –Étude du promoteur de TWIST2 Cellules ADAS : surexpression des gènes MYC –induction des gènes TWIST ? E3 non consensus E2 boite E E1 boite E -93 boite TATA INR TWIST1 Twist1 Twist2 Max Myc Coactivateur Corepressseur Miz1 Max Mad

45 Cellule Souche Cancéreuse & Cellules ADAS Le modèle de progression tumorale à partir des ADAS Transformation d une cellule « souche » avec nos gènes dintérêt : MYC et/ou TWIST Théorie de la Cellule Souche Cancéreuse (CSC): Acquisition de propriétés oncogéniques ? Maintien des propriétés souches des cellules ADAS ? Cellules tumorales Cellule souche normale Cellule Souche Cancéreuse Cellule différenciée mutationsdédifférenciation Adaptée de Pardal et al., 2003 Conclusions & Perspectives

46 Modèle de progression tumorale à partir des cellules ADAS Les cellules ADAS P0 chimiorésistantes –ADAS + MYC et/ou TWIST Maintien chimiorésistance ? Régression Rechute Thérapie conventionnelle Thérapie ciblée contre les CSC Tumeur Cellules ADAS : modèle pertinent pour la théorie de la CSC Adaptée de Pardal et al., 2003 Conclusions & Perspectives

47 Les gènes MYC & TWIST dans les cellules ADAS Surexpression des gènes MYC, TWIST ou MYC & TWIST –Cycle cellulaire, apoptose et sénescence –Maintien de la chimiorésistance ? –Maintien des propriétés « souches » ? Injection dans des souris nude Formation de tumeurs ? Localisation particulière ? « Homing » ? Clones en agar mou Culture en 2 Dimensions Transformation ? Immortalisation ? Cellules ADAS surexprimant c-MYC ou N-MYC et/ou TWIST1 ou TWIST2 Conclusions & Perspectives

48 Les gènes TWIST nouvelles cibles thérapeutiques Rôle crucial des gènes TWIST dans la tumorigenèse –Induction de lEMT –Inhibition des systèmes de sauvegarde cellulaire –Chimiorésistance –Dérégulation dans de nombreux cancers Thérapie anti-Twist : Cellule Souche Cancéreuse –Couplée avec thérapies conventionnelles Nouvelles perspectives –Neuroblastome –Autres cancers exprimant les gènes TWIST : sein, foie, prostate, gliomes… Conclusions & Perspectives

49 Remerciements Léquipe : Dr S. Wittmann V. Belin E. Garin AC. Jallas J. Putelat Les membres du Jury Pr G. Gillet Pr F. Berger Dr S. Douc-Rasy Dr S. Wittmann Le comité de thèse Dr M Billaud Dr J Bénard Nos collaborateurs Dr V. Maguer-Satte, CLB Dr E. Delay, CLB Dr A. Privat, INM Dr MD. Hogarty, TCH Dr J. Bénard, IGR Dr L. Bartholin Dr S. Ansieau Pr A. Puisieux INSERM U590, Centre Léon Bérard Les « étudiants » Ligue Nationale Contre Le Cancer

Merci !