VACCINER LES LAPINS SAUVAGES CONTRE LA VHD, SANS AVOIR À LES CAPTURER. OBJECTIF VACCINER LES LAPINS SAUVAGES CONTRE LA VHD, SANS AVOIR À LES CAPTURER. Sans oublier les lièvres contre l’EBHS

Pistes déjà explorées 1/ Production de capsides sans noyaux (vaccin commercial) - Valable pour les élevages 2/ Recombinants Myxo-VHD (Ecole Véto Toulouse et équipe espagnole) Efficacité terrain non prouvée (mauvais choix de départ) L’ONC aujourd’hui à des a priori contre de telles recherches si elles étaient tentées par Bio-Espace, après les avoir soutenues lorsqu’elles étaient menées par les équipes citées ci-dessus 3/ contre l’EBHS rien.

Notre approche ? naturelle Elle consiste à vouloir obtenir un virus atténué de la VHD, et à l’utiliser comme vaccins. (analogue à notre stratégie myxo)

Pourquoi une telle stratégie ? 1/ Il n’existe pas de solutions au problème posé 2/ Notre approche est cohérente avec l’air du temps, 3/ Elle n’est scientifiquement pas utopique.

En effet, Le virus naturellement atténué de la VHD existe. Travaux des Italiens (Capucci et al) Intéressant, Mais virus trop atténué Difficilement multipliable. Mais conclusion, il existe, et on en connaît le code.

Virus de la VHD détails

Virus de la VHD 40 nm ARN simple brin 7437 bases Virus de la Myxomatose 2OO nm ADN double brin 161 773 Paires de bases 125 fois moins volumineux que celui de la myxo

Virus pathogène de la VHD Structure déterminée aux rayons X . Forme géométrique Icosahedre (20 faces) La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides). Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.

Voyons comment un virus tue.

Il se réplique dans certaines cellules Il se réplique dans certaines cellules. Pour rentrer il utilise ses sites de reconnaissance situés sur la capside.

(suite) Il se multiplie dans le foie, nécrose cet organe et détruit les facteurs de coagulation. En même temps il agresse les parois des capillaires. La conséquence c’est l’hémorragie.

Défenses du lapin.

Le lapin crée des anticorps contre ces virus Le système immunitaire du lapin crée des anticorps Virus VHD Le virus emprisonné par les anticorps est éliminé

L’anticorps se lie à quoi ? Aux protéines de la capside.

Importance de la capside, Dans un virus pathogène, les protéines (VP60) de la capside ont 579 AA. Dans un virus naturellement atténué (celui de Capucci), les protéines (VP60) de la capside ont 576 AA. Le premier tue, le second protège.

Peut on produire le virus trop atténué de Capucci, ou un autre encore plus intéressant ? pas de façon classique mais en faisant de la mutagénèse dirigée. C’est notre programme de recherche.

Mutagénèse dirigée L’objectif est de modifier la structure de la capside, tout en gardant le virus entier.

Virus pathogène de la VHD Capside, constituée de la même protéine (579 aminoacides) repétée plusieurs fois. code ARN 7437 b, à l’intérieur.

Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b) Il est fragile. Nous l’avons traduit en ARN double brin, plus stable pour l’étudier et le modifier.

Code ADN à double brin

VHD souche Pascal 1/ Foie de lapin envoyé par Pascal. 2/ Extraction de l’ARN viral 3/ Transcription en ADN 4/ Lecture du code Résultats :

Les 3960 premières pb de notre virus de la VHD

Les 3477 pb suivantes. au total 7437 pb

Dans les conditions naturelles la capside se forme dans les cellules par lecture du code

Nous avons Identifié et isolé la seule partie du code qui exprime la protéine VP60.

Elle n’est pas là. Les 3960 premières pb du virus de la VHD

Elle est là. En rouge les 1737 pb du gène codant pour la VP60

Nous avons comparé, Le code VP60 de notre virus pathogène (Pascal) À celui du virus non pathogène de Capucci. Résultat :

Dans les 840 premières pb, l’alignement est identique

On note une différence entre 900 et 960 pb

On note une différence entre 900 et 960 pb

Rien à la fin

Traduit en code AA, cela donne

Comparaisons entre VHD non pathogène (Capucci) VHD pathogènes souches France Espagne Italie Allemagne Et la souche EBHS pathogène pour le lièvre

Conclusions Peu de différences

Comment intervenir Pour modifier ces codes, et rendre moins pathogènes ces virus qui tuent les lapins et les lièvres.

Processus général de clonage d’un génome Genome viral complet Extrait du foie d’un lapin Envoyé par Pascal. Vecteurs de clonage (ou plasmides) DNA 3000 Pb Capables de vectoriser les DNA Ligation de l’ ADN du génome avec le vecteur de DNA plasmide recombiné Incorporation dans une bacterie Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide.

Clonage d’un gène Genome viral complet Extrait du foie d’un lapin Envoyé par Pascal. Vecteurs de clonage (ou plasmides) DNA 3000 Pb Capables de vectoriser les DNA fraction du génome Correspondant à la VP60 Ligation de l’ ADN du génome avec le vecteur de DNA plasmide recombiné Incorporation dans une bacterie Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide.

Nous avons cloné le gène de la protéine VP60 (traduit en langage ADN), nous l’avons incorporé dans un plasmide, et l’avons multiplié dans une bactérie. Nous allons faire la même chose pour le génome complet du virus de la VHD

Nous allons voir comment il est possible de remplacer certaines lettres d’un code par d’autres lettres plus intéressantes.

Que faire d’un génome modifié, inséré dans un plasmide.

Il faut l’introduire dans une cellule pour que celle-ci redonne le virus reconstruit. On parle alors de transfection, par opposition à infection. Le piège à éviter lors de ces transfections, C’est la digestion des plasmides par des enzymes particulières dès l’entrée dans la cellule.

Comment éviter ces enzymes En protégeant les plasmides par des macromolécules spéciales.

+ + + - - + - + - + - - + - - - + - + - - Un plasmide c’est un polyanion. On le protége avec un polycation à condition que ce dernier ne soit pas toxique pour la cellule + + + - - + - + - + - - + - - - + - + - -

Ces molécules existent + + + Nous sommes en train d’en créer d’autres.

Certaines sont linéaires

D’autres sont sphériques

Etapes nécessaires pour livrer efficacement les plasmides. Complexes DNA Protégés, vers des cellules cibles. Nucleus Nuclear Import

Conclusion Nous avons, en 7 mois : 1/Analysé exhaustivement la littérature, et affiné notre stratégie de recherche. 2/ Isolé le virus de la VHD, 3/Analysé son code génétique. 4/ Comparé celui-ci à celui du virus naturellement atténué de Capucci 5/ Comparé à celui de l’EBHS du lièvre 6/ Isolé le gène de la VP60, et cloné celui-ci dans un plasmide. 6/ Créé des molécules de transfection, et les avons testé parmi d’autres. 7/ Abordé la recherche de cellules permissives.

Pour votre patience et pour votre attention. Merci à tous Pour votre patience et pour votre attention.