Question posée Action des agonistes partiels sur la sous-unité NR1 (site liaison glycine) des récepteurs NMDA (NMADRs) Paradigme du GluR2 pour laction des agonistes partiels est-il applicable aux NMDAR? Trouver modèle daction des agonistes partiels

Contexte Fonctionnement général des R canaux (changement conformationnel après liaison du ligand) Peu de connaissances au niveau atomique sur les états conformationnels des récepteurs canaux selon quils sont liés à un agoniste total ou partiel Rappel de la définition de lagoniste partiel (entraînent une activation submaximale du canal ionique) 2 théories sur les méca de fonctionnement des agonistes partiels Cristallographie (changement conformationnel), électrophysiologie (activation canal ionique) S1S2 ligand binding core Propriétés connues pour AMPAR : 1) fermeture complète activation complète ; fermeture incomplète activation partielle 2) dimérisation Différences connues AMPA/NMDA : homo/hétérodimères ; glycine Ce qui a déjà été trouvé : structure similaire GluR2 – NR1 MAIS structure cristallographique montre même degré de fermeture avec agoniste total et partiel dans une étude avec un agoniste partiel

Méthodologie Structure et fonctionnement du NMDAR en présence dune série dagonistes partiels Composants qui diffèrent par un seul groupe méthyl - CH2- : 2 agonistes partiels et un antagoniste (3 molécules avec cycle carbonique de taille croissante) : ACPC, ACBC, cycloleucine 1) structure : NR1 lié à chacun des 3 (cristallographie) 2) force du lien 3) électrophysiologie : WT et NR1 mutants (importance de lactivation et spécificité des interactions)

Résultats (1) expériences de déplacement Déterminer affinités relatives (Ki) ACPC, ACBC, cycloleucine Utilisent un antagoniste compétitif Voient le déplacement induit différences dEC50 Cf résultats ACPC se lie avec 5,5 fois plus daffinité / ACBC 31 fois moins / cycloleucine 581 fois moins Différences subtiles

Résultats (2) activation NMDAR étude electrophysiologique sur ovocytes de batracien(modèle xenopus oocytes)= courant diminue de ACPC à cycloleucine ACPC + glutamate effet agoniste partiel pas seulement lié à lantagonisme par liaison sur NR2B Confirment que ACPC et ACBC sont agonistes partiels et cycloleucine antagoniste

Résultats (3) cristallographie Pour comprendre bases moléculaires de lactivité des 3 molécules sur les NMDAR Cocristallisation NR1 S1S2 avec chacun des 3 composants « replacement moléculaire » = superposition (modèle : glycine/NR1 S1S2 pour ACPC et ACBC et domaines 1 et 2 de NR1 S1S2 pour cycloleucine) Toutes ces structures partagent configuration à deux domaines en packman, similaire à GluR2 Localisation du site de liaison spécifique des ligands est possible malgré «bruits » ACPC : réseau pont hydrogène entre 3 résidus du domaine 1 et 2 résidus du domaine 1 + groupe alpha carboxyl de lACPC forme une liaison électrostatique avec une Arg du domaine 1 et un pont hydrogène avec une sérine + groupe alpha aminé fait…. Mêmes contacts mais différences (conformation de certains aa et position dune molécule deau)

Augmentation taille de la poche de la glycine à lACBC (pas de poche pour la cycloleucine) Tryptophane poche se déforme en fonction de la taille du ligand par lintermédiaire de la modification du Trypt (taille du ligand « perçue » par lintermédiaire de la chaîne latérale du trypt) Décrit en fonction du ligand les changements de position (shifting) des aa, qui sont spécifiques en fonction de ce ligand

Résultats (4) comparaison de la fermeture du domaine et de lactivation du récepteur Confirmation pour GluR2 Même fermeture du packman pour les agonistes totaux et partiels de NR1 Donc mécanismes moléculaires différents entre GluR2 et NR1 induits par les agonistes partiels

Changements conformationnels induits par agonistes partiels Sur WT et sur mutants Même fermeture du domaine mais conformations différentes pour 8 résidus sur brin 14 situé à la charnière du packman Pourquoi une conformation différente? Certains ponts hydrogènes conservés dans tous les complexes/conformations différentes pour certains résidus Ex de résidus importants : Phe 754 (liaison ago niste et gating) et Val 689 (affinité pour lagoniste)

Interactions entre domaines pour NR1 et GluR2 Liaisons non covalentes entre les 2 domaines Dans les 2 cas, beaucoup de sites de contacts entre les 2 domaines, encore plus dans NR1 Pour NR1 : conservation de certains ponts hydrogènes de part et dautres de la poche de liaison chez agonistes partiels et totaux

Dimérisation NR1/cycloleucine Dimère comparable à GluR2/kainate Interface de dimérisation : hélices D et J 2 à 2 (D/J et D/J) En microscopie électronique : densité non protéique non identifiée supposition : petite molécule anionique, située à linterface du dimère

Discussion Différence AMPA/NMDA en présence dagoniste partiel (cf 2 modèles dagonistes partiesl : différence de fermeture ou différence dans le déplacement de léquilibre vers la droite) Ponts hydrogènes ferment la poche de liaison même si volume de + en + important Capacité du site de liaison à sadapter à différents volumes de ligands jusquau volume de lACBC (ex : Val 689) Même si fermeture du domaine est complète avec les agonistes partiels, cette position fermée est moins stable car les changements conformationnels sont incomplets par rapport à ceux induits pas les agonistes totaux Importance de la Phe754 pour stabiliser la conformation de la charnière et pour communiquer les changements conformationnels de la poche à cette charnière, initiant la fermeture du domaine En dépit de la déformation conformationnelle incomplète (antagonist-like) induite par les ago partiels, comment se fait-il que le packman soit et reste fermé? Il existe un loquet constitué par les nombreuses interactions non covalentes de part et dautres de la poche de liaison (liaisons polarisées et non polarisées) Dimérisation : identique à celle des GluR2 mais on ne sait pas si homodimères ou hétérodimères (pensent quhomodimères mais nécessité de confirmation) Molécule inconnue électropositive (cf modèle de la cyclothiazide) pour stabiliser le dimère