Les Îlots de pathogénicités (PAI) Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes Denis Dacheux-Deschamps

Les Îlots de pathogénicités (PAI)

la conjugaison, la transduction et la transformation. Le monde bactérien 5000 espèces de bactéries décrites, 200 000 à 500 000 espèces bactériennes estimées, 200 sont pathogènes pour l’Homme. séquençage exponentiel des génomes de Bactéries pathogènes ou non Transferts de gènes via la conjugaison, la transduction et la transformation. Génome bactérien : « partie centrale (cœur) et partie flexible »

Génome procaryote Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

Genomic Islands > 10kb PAI Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

Genomic Islands Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol.

Îlots de Patogènicité (PAI) int virA virB virC mobA ∆mobB Pathogène Non-Pathogène tRNA Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol. int : gènes d’intégrase ; vir : gènes de virulence ; mob : gènes de mobilisation E. coli puis nombreuses bactéries Gram + ou Gram – (pathogènes de plantes ou animaux) 10 à 200 kb, % G+C différent, extra- ou intrachromosomique, PAI absent chez les bactéries non pathogènes de la même espèce

Fonctions associés aux PAI Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

Gènes de virulence associés aux PAI Adhésines ex : intimine adhérence intestinale pour EPEC/EHEC (attachement effacement) Système de sécrétion Principalement le SS de type III (TTSS) et le type IV Invasines, modulines Ex : Salmonella 5 PAI (SPI) SPI-1 invasion C. épithéliales SPI-2 intracellulaire prolifération SPI-3&-4 intramacrophage survie SPI-5 inflammation et sécrétions intestinales Toxines Pore forming : hémolysine (UPEC), listériolysine O (Listéria sp) Protéase, lipase, enterotoxine, ADP ribosilation (prot G) Superantigène Système capture du fer Récepteur au fer : sidérophores (yersiniabactine…) Autres Résistance sérum, apoptose, IgA protéase, gènes inconnus

Régulation des PAI Gènes de régulation codés par le PIA ou extérieur : Activateur de transcription type AraC (TTSS ExsA ; VirF 37°C Yersinia) + Régulateur de réponse à deux composants (PhoP/PhoQ, Mg 2+, SPI-1) Facteur sigma Histones

Sites intégrations des PAI DR DR DR: direct repeat 9-135 pb parfois similaire au site att des phages ou IS (élément d’insertion) 75% des PAI insérés en 3’ des ARNt

Intérêt des tRNA Insertion ancestrale des phages ou plasmides Plusieurs copies du gène ARNt Gène ARNt non indispensable (ex selC ARNt) selC ARNt (selenocystéine) le plus ciblés Utilise souvent le promoteur

Mobilité des PAI Intégrase, recombinase généralement codées par le PAI Souvent par transduction (lors d’infection) (supposé) Intra-chromosomique (Yersinia), Intra-espèce, Inter-espèce (supposé) perte mobilité (mutation, délétion) ….Évolution

Évolution des PAI Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol.

Le système de sécrétion de type III chez les bactéries pathogènes (TTSS) chez les bactéries pathogènes

Les facteurs de virulence bactérienne Survie et multiplication Antibiotiques Phagocytose Exopolysaccharide Adhésion cellulaire Flagelle Pili Survie et multiplication dans l’hôte Type III Phospholipase Elastase Type II Exotoxine ... Systèmes de sécrétions protéiques Type I Protéase alcaline ... Type IV CagA... Plasmide Ti Type V Auto- tranporteur

Les différents systèmes de sécrétion des bactéries Gram-négatives Nombreuses protéines bactériennes sécrétées, d’activités diverses dont des facteurs de virulence. Type I à V (I et III sec indépendant) Exportation, sécrétion, translocation

Le système de sécrétion de type III (TTSS) Injection dans le cytoplasme de la cellules Eucaryotes (Translocation) de protéines bactériennes toxiques. Contact physique Cellules - Bactéries Toxines injectées homologues à des protéines Eucaryotes agissant sur les voies de signalisation.

La sécrétion de type III chez les bactéries Gram-négatives Identifiée chez de plus en plus de bactéries pathogènes Phyto-Pathogènes : Pseudomonas syringae, Erwinia spp., Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Rihzobium spp. Pathogènes d’animaux : Intracellulaire Extracellulaire

La sécrétion de type III chez les pathogènes animaux Burkholderia Bortedella BopC P. aeruginosa ExoT ExoS ExoY ExoU Mort cellulaire Caspases NF-kB IpaA IpaB Shigella d’actine Cytosquelette Yersinia YopP/J YopE YopT YopH YopM MAP Kinase Inflammation SipB SipC SopB SipA SopE Salmonella EPEC Tir EspB Intracellulaire Extracellulaire

Isolation du système de sécrétion de type III Structure du complexe inséré dans la paroi bactérienne Complexe isolé (Sukhan et al., 2001, J. Bac) (Kubori et al., 1998, Science)

Purification du complexe (« seringue + aiguille = Injectiosome ») Salmonella typhimurium Yersinia enterocolitica schema (Kimbrough et Miller 2000, PNAS) Shigella flexneri (Cornelis 2002, Nature) (Blocker et al., 2001, Mol. Mic)

Diversité des systèmes de sécrétion de type III bactériens (Cornelis 2002, Nature)

Structure de l’appareil de sécrétion de type III « Injectiosome » 12 nm Appareil de translocation « Translocateur » 2 à 4 nm 50 nm Appareil de sécrétion Membranes bactérienne 30 nm Cytoplasme bactérien Effecteurs toxiques type III

Organisation génétique des gènes codant l’appareil du TTSS Gènes regroupés en « cluster » ou « îlot de pathogénicité » (PAI). Souches non pathogènes ne possèdent pas ces PAI. Cluster de gènes présent soit sur le chromosome bactérien ex: S. typhymurium, P. aeruginosa, EPEC soit sur un plasmide ex: S. flexneri soit sur les deux ex: Yersinia spp. Gènes organisés sous la forme d’opérons. Gènes de structure du TTSS très conservés entre différents pathogènes.

Gènes codant l’appareil du TTSS (15 à 20 gènes) Animaux Végétaux Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

Modèle d’assemblage du complexe TTSS Galan, 2001 Annu. Rev.Cell. Dev. Biol. Marlovits, 2006 Nature

Caractérisation structurale de la base du TSS EscJ(EPEC) (Calvin et al 2005, Nature)

Gènes codant les effecteurs bactériens injectés Gènes localisés à l'extérieur des clusters: - sur plasmide de virulence associés aux gènes du TTSS. - ou dispersés sur le chromosome Co-régulation transcriptionnelle avec les gènes de l’appareil du TTSS. Protéines variant en taille, structure et fonction et espèces-spécifiques. Certains domaines des effecteurs sont homologues entre différentes bactéries. Effecteurs possédant des activités eucaryotes. (origine eucaryote)

Fonctionnement du TTSS 1. Appareil de sécrétion exprimé à la surface de la bactérie en position fermée par protéines. 2. Contact avec membrane cellule eucaryote, ouverture du canal, (position ouverte). 3. Sécrétion protéines du translocateur, par la canal s’insérant dans la membrane eucaryote (pore). Communication entre cytoplasmes bactérien et eucaryote. 4. Translocation des effecteurs protéiques dans la cellule cible.

Modèle générale du TTSS Blocker et al., 2000 Mol. Micro.

Exemple de Modèle du TTSS chez Yersinia spp. (Cornelis 2002, J.C.B.)

Régulation transcriptionnelle des gènes du TTSS Activateur transcriptionnel commun de type AraC, actif sur tous les opérons et gènes du TTSS (effecteur et structure). Régulateurs de réponse à deux composants espèce-spécifique. Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

Exemple de régulation transcriptionnelle Yersinia spp. S. flexneri - ExsA P. aeruginosa + + exsD psc pop exs C B A + exo

Signaux d’activation transcriptionnelle in vitro Température : induction à 37°C (Yersinia, Shigella) Osmolarité (Shigella, Pseudomonas, Salmonella) pH : répression si inférieur à 7-8 (Shigella) activation si acide (Salmonella) Phosphate : (Salmonella) Oxygène : (Salmonella) Calcium/ Magnésium : répression (Yersinia, Pseudomonas, Salmonella )

Signaux d’activation transcriptionnelle ex vivo / in vivo Contact cellule-bactérie Pettersson et al, 1997 Science Y. pseudotuberculosis / HeLa

Signal de sécrétion des effecteurs via le complexe TTSS Nter Cter -15ème au 100ème AA Nter reconnu par une protéine chaperonne. (ex YopE et SycE). 100 Modèle des chaperonnes 1 15 AA Modèle ARNm -15er AA Nter suffisant pour certaines protéines (ex: YopN) -pas séquence signal identifiée mais structure sur ARNm incluant AUG.

Les deux modèles de sécrétion Ribosome ARNm yop Répresseur traductionnel yop Récepteur ribosome Chaperonne Syc Protéine de fermeture Récepteur chaperonne Polypeptide yop Andersonet al, 1999 Trends Micro.

Les protéines chaperonnes Nter Cter 14 kDa pHi acide (4,4 à 5,2) hélice  amphiphile Fixation Protéine effectrice séquence putative AA reconnue. à proximité du gènes de l’effecteur à fixer. maintiennent conformation (non active) de l’effecteur, indispensable à la sécrétion. Non présentes pour tous les effecteurs à transloquer.

La translocation Signal in vivo : contact Cellules / Bactérie Contact Cellule cible Bactérie Contact Activation de la sécrétion de type III

Pseudomonas et Yersinia effecteurs inductibles (répression avant contact) Translocation directionnelle

Salmonella (SP-1) et Shigella Translocation non directionnelle effecteurs accumulés avant contact

Schlumberger et al, 2005 PNAS. = non invasive = SPI-1 TTSS- Schlumberger et al, 2005 PNAS.

Schlumberger et al, 2005 PNAS. Start 10-90sec End pool 100-600 sec (6-/+3.103molecules) Schlumberger et al, 2005 PNAS.

Contact = récepteurs in vivo ? Récepteurs bactériens Récepteurs bactériens et ligands cellulaires ? Cellule cible Bactérie Activation de la sécrétion de type III Récepteurs Récepteurs bactériens TTSS identifiés ex : Yersinia YopN Salmonella SipD Shigella IpaD Ligands cellulaires ex: Intégrine 51 ( IpaA, IpaC, IpaD)

« Le translocateur » Bactéries Cellules m B mp C. contact transclocateur Effecteurs

« Le translocateur » YopB Yersinia YopD Shigella IpaB Domaines hydrophobes ( ) formant spontanément des pores membranaires (hémolyse) Chaperonnes car lytiques pour bactéries (YopB / SycD) Bi-fonctionnelle effecteur/translocateur (IpaB, SipB)

Les effecteurs de type III, sécrétion in vitro CHA- ExsA CHA- ExsA CHA- ExsA CHA- ExsA CHA- ExsA P. a ExsA P. a CHA ExsAC ExsAC ExsAC ExsAC ExsAC Pseudomonas aeruginosa EGTA/MgCl2 EGTA/MgCl2 EGTA/MgCl2 - - - + + + - - - - - - - + + + + + + + - - - - - + + + + + ExoS ExoT PopB PopD kDa kDa kDa 98 98 98 64 64 64 ExoS ExoT PopB PopD ExoS ExoT PopB PopD Effecteurs 50 50 50 36 36 36 Translocateur 30 30 30 Dacheux et al, 1999 Infect. Immun. Induction sécrétion in vitro (mime le contact) : - Déplétion en Calcium (Pseudomonas, Yersinia (+37°C)) - Colorant Rouge Congo (Shigella, Salmonella)

Détermination de la taille du pore Osmoprotection Hémolyse (540 nm, %) RPMI sucrose raffinose 1000 2000 3000 4000 20 40 60 80 100 P.a P.a pcrV 6000 1500 PEG Diamètre de 1,3 à 3 nm Dacheux et al, 2001 Mol. Mic.

Modèle PopB/PopD (P. aeruginosa) Schoehn et al, 2003 EMBO

PopB/PopD et liposome (MET) PopB autre coloration PopD PopB/PopD PopB/PcrH Schoehn et al, 2003 EMBO

Les effecteurs de type III, sécrétion in vivo Appareils de sécrétion homologues entre espèces alors que effecteurs diversifiés spécifiques de l’espèce (voir spécificité clonale) Tous ne sont pas des effecteurs toxiques (éléments de régulation, de translocation) Effecteurs toxiques devenant actifs dans le cytoplasme cellulaire agissant sur voies de signalisation. But: tuer (B. extracellulaire) ou entrer (B. intracellulaire) dans la cellule. Responsables des phénotypes infectieux spécifiques. (mutants TTSS moins virulents)

Protéines sécrétées par le TTSS (pathogènes d’animaux)

Activités des effecteurs de type III Kinase sérine/thréonine Multiples ou unique Adénylate cyclase (ExoY) ADP-ribosylation (ExoS, ExoT) Tyrosine Phosphatase (YopH) Kinase sérine/thréonine (YopO, StpP) Récepteur bactérien (Tir) Lipase (ExoU) Inconnues (YopJ, SipC, YopM…) GAP (YopH, StpP)

Effets des effecteurs de type III Modification du cytosquelette ExoT ExoS ExoY Morphologie arrondie P. aeruginosa SipB SipA IpaA IpaB IpaC Rho, Rac cdc42 SopE « Ruffling » Shigella Cytosquelette Inhibition phagocytose YopE YopT YopH YopO d’actine Yersinia Salmonella Tir EspB EspA « Piédestal » EPEC

Inhibition phagocytose Signalisation cellulaire et inflammation NF-kB Cytokine (TNF, IL1, IL8) Inflammation Inflammation MAPKinase Cytokine (TNF) IpaC Shigella Inhibition phagocytose IpaB IpaA YopT Yersinia YopP/J SipA SipB Salmonella YopE SopE YopH EspB EPEC

Trafic intracellulaire YopM P. aeruginosa ExoY IpaD Shigella IpaB AMPc IpaA Phagosomes Lysosomes Yersinia SipC Salmonella SopE EspB Tir EPEC

Oncose / Apoptose Mort cellulaire ONCOSE (oncos, swelling) APOPTOSE gonflement de la cellule et du noyau désintégration de la membrane plasmique absence de fragmentation de l’ADN condensation de la cellule formation de protubérences membranaires (budding), fragmentation ADN, formation de corps apoptotiques NECROSE Phagocytose par macrophages Inflammation Majno et al., 1995 Am. J. Pathol.

Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity. Oncose / Apoptose J774 Temoin Oncose Apoptose précose Apoptose tardive Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity.

Mort cellulaire APOPTOSE Shigella Yersinia Salmonella ONCOSE YopE YopT P. aeruginosa ExoT ExoS SipB Salmonella IpaB Shigella YopP/J IpaC ExoU Caspase 1-3- 7 APOPTOSE Inflammation ONCOSE

Origine flagellaire de la sécrétion de type III Flagelle TTSS Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev. Homologie avec les gènes codant l'appareil d'assemblage du flagelle. Yersinia : appareil flagellaire sécrète facteur de virulence (YplA). Evolution: B. Végétaux puis animaux transferts horizontaux (plasmides, PAI mobiles) entre bactéries. protéines de la mb externe homologues protéines appareil Type II

Structure et fonction du TTSS conservées entre especes Transcomplémentations hétérologues : Mutant Yersinia YopBD complémenté par PopBD de Pseudomonas Frithz-lindsten et al, 1998 Mol. Micro. Mutant Shigella IpaA complémenté par SipB de Salmonella

Structure et fonction du TTSS conservées entre especes Transcomplémentations hétérologues : Mutant Yersinia YopBD complémenté par PopBD de Pseudomonas Frithz-lindsten et al, 1998 Mol. Micro. Mutant Shigella IpaA complémenté par SipB de Salmonella

Structure et fonction du TTSS conservées entre especes Transcomplémentations hétérologues : Mutant Yersinia YopBD complémenté par PopBD de Pseudomonas Frithz-lindsten et al, 1998 Mol. Micro. Mutant Shigella IpaA complémenté par SipB de Salmonella

Virulence du TTSS in vivo Exemple: infection à Salmonella thyphimurium Galan, 2001 An. Rev.Cell.Dev.Biol.

Exemple supposé: infection Pseudomonas aeruginosa Bactérie Phagocytes Exemple supposé: infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa Adhésion Activation de la sécrétion de type III (ExoS, ExoT, ExoU, ?) Médiateurs toxiques Oncose Répression de la sécrétion de type III Epithélium pulmonaire

Système de sécrétion de type III , outils thérapeutiques ? Objectif : infection virale Délivrer dans les cellules, par le TTSS d’une bactérie atténuée, l’épitope présenté par le CMH I pouvant activer les LT CD8+ spécifiques. Ces LT CD8+ pourront alors éliminer la future infection virale.

Vaccination de souris contre virus LCMV avec S. thyphimurium injectant l’épitope protecteur via TTSS. Epitope non protecteur Epitope protecteur SipD- (TTSS-) Contrôle LCMV: Lymphocytic choriomeningitis virus Rüssmann et al, 1998 Science

Activation de LTCD8+ spécifiques de l’infection au SIV chez le Macaque rhésus par ingestion de Salmonella sécrétant l’épitope Evan et al, 2003, J. Virol.

Diversité clonale des effecteurs de type III parmi des souches infectieuses de P. aeruginosa exoS,exoT,exoY exsA CHA CF1 CF2 CF3 CF5 CF6 CF7 CF8 CF9 CF10 CF11 CF12 CF13 CF14 CF15 CF16 CF17 CF18 CF19 CF20 RIE REN7 REN3 T6 37.11 K569 REN4 CF4 REN0 7 kb + - Sécrétion 80 20 40 60 % Cytotoxicité (J774) 8 3 2 exoU Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity.

Inhibition phagocytose chez Yersinia sp

Wolf-Dietrichet al, 1998 Cell « Ruffling » Shigella Salmonella Wolf-Dietrichet al, 1998 Cell

« Piédestal » Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity. Morphologie arrondie « Round up, flat eggs » J774 non infectés J774 infectés Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity.

Effet apoptotique des Yops de Yersinia sp

Dacheux et al, 2001 Mol. Mic.

Effets anti-inflammatoires des Yops de Yersinia sp