Les biopuces et le grand séquençage: des outils pour comprendre le vivant à l’échelle génomique Partie 3: applications Philippe Kastner ESBS – septembre 2009

Utilisation des biopuces pour l’étude du transcriptome Conception d’une expérience de microarray Méthodes d’analyse Exemples d’application

Comment concevoir une expérience de microarrays ? But: déterminer les variations biologiques entre différents échantillons. Mais il faut distinguer celles-ci des variations liées à la technologie, ou à celles liées à la variabililé intrinsèque des échantillons

Thomas Hudson, Montreal Genome Center

Intensité croissante

Différences d’expression réelles ou artéfactuelle ? 6 échantillons: A1, A2, A3, B1, B2, B3 Microarray comprenant 20 000 gènes échelle d’expression: 1- 10000 Mesures pour un gène X A1 A2 A3 B1 B2 B3 25 30 35 55 50 66 Test t: p = 0,01 Pour combien de gènes une telle valeur peut-elle être obtenue par hasard ? (« false discovery rate », ou FDR)

Estimation du nombre de gènes différentiels « réels » Comparaison Nombre de gènes différentiels (Changement > 2x, p <0,01) (A1, A2, A3) vs (B1, B2, B3) 300 (A1, B2, A3) vs (B1, A2, B3) 150 (A1, B2, B3) vs (B1, A2, A3) 200 (A1, A2, B1) vs (B2, B3, A3) 100 La moitié des gènes différentiels est artéfactuelle ! Solutions: multiplier les réplicats augmenter la stringence des critères de sélection.

Combien de réplicats sont-ils nécessaires pour une expérience réussie ? variabilité Number of replicates Type of sample Cell lines Mouse cells Mouse organs Human cells Human tumors Interested by Big changes 2 2-3 3-4 5-6 >30 Small changes 4-5 10 10-15 >60

Deux grands types de méthodes de « clustering » Méthodes hiérarchique: génération d’un dendogramme (arbre) qui relie tous les gènes ou échantillons entre eux. Méthodes par partitionnement, qui divise les gènes en K classes ayant des profils similaires (K défini par l’utilisateur) - K-means - Self-organizing maps (SOM) - analyse par composantes principales (PCA)

Regroupement en fonction de profils d’expression similaires 700 gènes 1. Gènes Évolution temporelle de l’expression des gènes dans des fibroblastes humains stimulés par du sérum (Pat Brown, 1997) (Première expérience publiée de microarrays) Visualisation d’une chorégraphie de l’expression génique dans le temps.

Regroupement en fonction de profils d’expression similaires 2. échantillons Different cell lines to be compared Genes belonging to one cluster Fold Changes 1 -2 -4 -6 +6 +4 +2

Méthodes par partitionnement (K-means, Fuzzy C-means, Self organizing maps) N expériences chaque gène est considéré comme un vecteur dans un espace de dimension N (coordonnées = valeurs d’expression dans chaque expérience) Partitionnement des gènes en K classes optimisées selon des critères de proximité des gènes dans l’espace vectoriel

Visualisation et sélection des classses de gènes intéressantes Analyse par partitionnement de données correspondant à 5 types de leucémies T (20 groupes) Visualisation et sélection des classses de gènes intéressantes

Analyse par partitionnement de données correspondant à 5 types de leucémies T (20 groupes) Ikaros bcat TelJak2 Tal-Lmo1

Visualisation des clusters FCM (4208 genes) B-catenin ICN1 Ikaros TelJak2 Tal-Lmo1

Applications des microarrays 1. Expression différentielle Question: pourquoi B est-il différent de A ? (KO vs WT; effet d’un traitement; sain vs malade, etc …) Comparaison de A et B 200 gènes différentiels !! Et ensuite ??? …. Extraction d’un sens biologique Analyse biographique Annotation fonctionnelle des gènes (gene ontology: codification des annotations) Identification de gènes candidats ou voies moléculaires

Exemple 1: Lymphomes thymiques chez des souris mutantes pour le gène Ikaros Recherche de la voie moléculaire impliquée dans le développement de ces tumeurs par une analyse du transcriptome.

Conception expérimentale 6 IkL/L tumors 4 Tel-Jak2 tumors 5 non tumoral thymocytes Genes specifically deregulated in IkL/L tumors ?

Notch upregulation is associated with tumors lacking Ikaros IkL/L tumors IkL/L tumor TelJak2 tumors Hes1 Notch1 Deltex 1 pT Notch pathway signature Expérience fondatrice d’un projet concernant le rôle d’Ikaros dans la régulation de la voie Notch.

Applications des microarrays 2. Transcriptome comme mesure phénotypique d’un système biologique Concept: Profil apparenté de l’expression des gènes implique une similitude d’état biologique Application principale: classification des tumeurs

Meta-analysis of 2285 tumors, from 20 different cancer types Projet « carte d’identité des tumeurs » de la Ligue contre le Cancer 2285 échantillons de tumeurs de 20 types de cancer différents 2198 probe sets

Example 2 : Cancer Expression Analysis Large Diffuse B-Cell Lymphomas (LDBCL) No reliable indicators to subtype them Analysis of >100 LDBCL samples, as well as normal subsets of B lymphocytes Hybridise to 18K human “lymphoma” slide Alizadeh et al. , Nature 2000 Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling.

Identification de deux groupes de tumeurs distincts

Mortality and LDBCL Pronostic différent pour les deux groupes de tumeurs

Signature transcriptomique Ensemble de gènes caractéristiques d’un état biologique donné type cellulaire (ex: signature des pDCs) stimulation d’une voie moléculaire (ex: Notch)

Exemple 3: analyse de la signature de cellules dendritiques plasmacytoïdes Liu et al, Nature Immunol, 2004

Comment les pDCs se développent-elles ? Controverses dans la littérature: Les pDCs sont-elles apparentées aux cellules myéloïdes (macrophages, monocytes) ou lymphoïdes (lymphocytes) ? Les pDCs sont-elles apparentées aux autres types de cellules dendritiques « conventionnelles », impliquées dans la présentation des antigènes ?

Une vue génomique des cellules dendritiques Assemblage de profils d’expression génique pour la plupart des types cellulaires immunitaires (macrophages, neutrophiles, lymphocytes B, T, NK, pDCs, cDCs) = « compendium » Pour l’homme et la souris Clustering pour visualiser les distances entre lignage Identification de programmes d’expression géniques conservés Robbins et al, 2008 (Genome Biology)

1. SOURIS Similitude des profils transcriptomiques des DC Principal component analysis (PCA) (Projection on first 2 dimensions) Hierarchical clustering

2. HOMME Similitude des profils transcriptomiques des DC Publicly available datasets on Affymetrix U133 v2 2. HOMME

Signature des DC de souris Pan-DC genes Conventional DC genes pDC specific genes (500 genes) (Fuzzy C-means clustering)

Signatures des DC humaines Conventional DC genes Pan DC genes pDC genes

B cells T cells pDCs cDCs Gènes les plus fortement associés à des types de cellules spécifiques Rouge: connu pour être spécifique de ces lignages B cells T cells pDCs cDCs Ebf1 Camk4 Epha2 Arhgap22 Cd19 4430004N04Rik Pacsin1 Btbd4 Klhl14 Trat1 Zfp521 Slamf8 Bank1 CxCr6 Sh3bgr 9130211l03Rik Pax5 Tnfrsf25 Tex2 Nav1 Blr1 Ccdc64 Runx2 Ct2a Ralgps2 Plcg1 Atp13a2 Avpi1 CD79b Lat Maged1 Spint1

Conclusion des études transcriptomiques Proximité des programmes géniques des pDC et cDC: les DC constituent-elles une branche développementale séparée du système hématopoîétique ? Signatures conservées entre l’homme et la souris Les gènes spécifiques des DCs sont largement inconnus

Exemple 4: Absence de cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) chez les mutants IkL/L

Les pDC sont-elles bloquées dans leur différenciation dans la moelle osseuse ? Présence d’une population exprimant un marqueur des pDC, 120G8, mais pas B220

La population 120G8+ mutante appartient-elle au lignage des pDC ? Analyse du transcriptome (Affymetrix: 45000 gènes) Comparaison à divers types cellulaires hématopoïétiques

(scatter plot) Surexpression de la plupart des gènes dérégulés

Visualisation des gènes spécifiques des populations WT et mutantes Clustering hiérarchique) Les pDC IkL/L possèdent la signature pDC Dérégulation (surexpression) d’un grand nombre de gènes Sous-signature commune avec les DC conventionnelles

Applications des microarrays 3. Data mining Recherche d’informations « cachées » dans les données de transcriptome Confrontation des données: - à d’autres sets de données transcriptomiques - aux données de séquence et d’organisation des génomes - aux données de fonctions des gènes

Exemple 5: Profils d’expression et recherche de motifs régulateurs Nature Genetics 22, 281 (1999) Question: En confrontant les séquences des promoteurs de gènes co-régulés, peut-on découvrir de nouvelles séquences régulatrices ? Données: de transcriptome du cycle cellulaire de levure (2 cycles) partition en 30 classes de gènes (K-means) pour chaque classe: Enrichissement par rapport à une fonction ? Présence de motifs spécifiques dans les promoteurs (1kb en amont du site d’initiation)? méthode: déplacement d’une fenêtre de 10pb à travers la séquence, recherche de séquences homologues dans les autres gènes du cluster  calcul d’un score (MAP score). Si MAP score >10 , = significatif

18 motifs dans 12 clusters Motifs spécifiques d’un cluster donné Éléments régulateurs connus et inconnus Identification de nouveaux sites régulateurs

Gènes co-exprimés Motif régulateur commun ? Présence d’un ou plusieurs motifs donné Gènes corégulés ?

General scheme (1) clustering-based approaches for finding motifs from gene expression and sequence data classify

General scheme (2) sequence(/knowledge)-based approaches for finding motifs from gene expression and sequence data

Données: levures cultivées dans différentes conditions Etude des promoteurs des groupes 1 et 4: enrichissement de deux motifs régulateurs, PAC et RRPE, souvent présents de façon conjointe.

Question: la présence de l’un ou des deux motifs PAC et/ou RRPE permet-elle de prédire la régulation du gène correspondant? Très bonne corrélation des profils d’expression qui contiennent la suite RRPE, PAC

Exemple 6: découverte de fonction de gènes Idée: gènes aux fonctions similaires sont régulés de façon similaire Compendium : base de données de profils d’expression (levures cultivées dans différentes conditions, souches mutantes, etc …) Gène à la fonction inconnue: - profil d’expression similaire à ??? - Souche mutante pour ce gène: profil similaire à ???

Exemple: découverte de la fonction du gène YER044C Souches mutantes Gènes Forte association avec des gènes impliqués dans la synthèse de l’ergostérol Validation fonctionelle

Exemple 7: recherche de gènes voisins co-régulés Question: la comparaison des profils d’expression géniques et des localisations chromosomiques permet-elle d’identifier des région de gènes corégulés ? Données: cycle cellulaire de la levure 1. Pour tous les couples de gènes, calcul des corrélation des profils d’expression (valeurs entre -1 et 1) 2. Représentation par ordre sur les chromosomes

Exemple de résultats

Exemple 8: influence de la localisation chromosomique sur le niveau d’expression génique Question: l’expression des gènes humains varie-t-elle en fonction de domaines chromosomiques ? Mesure du niveau d’expression de tous les gènes humains dans 12 tissus (SAGE) Représentation du niveau d’expression en fonction de la position géographique sur les chromosomes

Identification de domaines d’expression génique élevée (RIDGE) Exemple: chromosome 11 Identification de domaines d’expression génique élevée (RIDGE) influence de l’environnement chromosomique large sur la façon dont un gène est exprimé Positions sur le chromosome Intégration du niveau d’expression sur une fenêtre de 39 gènes tissus

Variations importantes des niveaux d’expression entre chromosomes

Corrélation entre densité génique et niveaux d’expression

Biopuces Analyse sans à priori des systèmes biologique: outils puissant générer des hypothèses Analyse globale, permettant de révéler des propriétés nouvelles, non visibles par des études restreintes.