Sécrétion des facteurs de virulence chez les bactéries GRAM négatives sophie bleves, romé voulhoux nawel ADJEROUD

Sécrétion Survie et Adaptation Protéines Enzymes Toxines Excrétion Elimination de Déchets Survie et Adaptation

six systèmes de sécrétion Extérieure M. Externe Processus Complexe Nécessite six systèmes de sécrétion Périplasme M. Interne Cytoplasme

Type VI

Vibrio cholerae Vibrio cholerae bactérie à gram négatif (bacille virgule en français) Forme: bâtonnet incurvé, mobile responsable du choléra chez l‘homme, une maladie épidémique contagieuse, par sécrétion de toxines (altère le transport mbnaire).

Sécrétion membranaire de toxine AB5 S/unité A Système de sécrétion type 2 S/unité B5

Type II secretion system of V. cholerae:. ATPase: EpsE Type II secretion system of V. cholerae: . ATPase: EpsE . Plateforme MI: EpsE, L, F, M . EpsD Sécrétion Exportation PetidaseEpsO Pseudopilins Pseudopilus (assemblageG)

Homologie T2SS-T4SS Pseudopilus Pilus Pseudopilins Pilins TYPE II TYPE IV

Bibliographie: Rôle de EpsG Surexpression G Constants ++++ + Apparition Pseudopilus à la surface eps Operon eps G All eps genes [EpsG] ATPase: EpsE Proteines Platforme MI

The Question is Comment? EpsG---EpsE EpsL Lien possible Lien Direct/Indirect ??? G G G Comment? EpsG---EpsE

Pourquoi L: Linker ? L E-G E G Bibliographie: Mutation en E supprime mutation en G Etude structurale E: a un site d’interaction avec L: E interagit avec G via L G-L L ? Lien E-G E G

Pour déterminer interaction EpsG-EpsL: Méthodologie Pour déterminer interaction EpsG-EpsL: 1- Pontage chimique (DSP)/Cross-Linking 2- Co-immunprécipitation

1. Pontage chimique (DSP) Figer / immobiliser ces molécules Molécules en interaction « faible » (difficile à détecter) (électrostatiques, hydrophobe...), Ou simplement à proximité l’une de l’autre Pontage covalent entre les 2 molécules Agents de pontage DSP, imidoester bifonctionnel, glutaraldéhyde, formaldéhyde.

(dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de Lomant Crosslinker DSP (dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de Lomant Principe: N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primaires. DSP+Pro1 Liaisons amides covalentes DSP-Pro1 Libération NH-ester DSP-Pro1(intermédiaire) Cross-Linked Product +Pro2 Pro1-DSP-Pro2 Réaction avec amine primaire

DSP 1 2 EpsL EpsG

2. Co-immunoprécipitation Technique d’identification des interactions protéine-protéine: Principe simple: montrer que les deux protéines EpsG-EpsL interagissent ensemble. Avec un anticorps dirigé contre G ou L pour purifier non seulement G mais aussi L, et inversement!

SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la biotine EpsG EpsL SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la biotine

RESULTATS

Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG Sans EpsG ou L Absence G-L: Il existe bien interaction EpsL -- EpsG 60kDa 35kDa Dimère EpsG 15Kda

Mesure activité Protéase Contrôle: Mesure activité Protéase Mutations epsL et epsG pas de sécrétion de protéase: complexe G-L nécessaire sécrétion Mutation résidu G: Gly-Val Asp-Glu Thr-Leu

Confirmation Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG Délétion d’epsG ou epsL Absence du complexe EpsL-EpsG

Co-immunoprecipitation 1. Anticorps anti-EpsG: Immunoblott pour EpsG Lanes 4, 6 Augmentation EpsG et complexe G-L Lanes 7, 9 Apparition EpsG-EpsL ??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

2. Immunoblott pour EpsG

Augmentation EpsL et complexe G-L 3. Immunoblott pour EpsL Lanes 7, 9 Augmentation EpsL et complexe G-L Lanes 4, 6 Apparition EpsG-EpsL ??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

4. Immunoblott pour EpsL

1- Clivage par PilD: Immunoblott pour EpsG Mutation pilD Pas de complexe G-L EpsG non clivée de PM élevé Clivage PilD Nécessaire au G-L

2-Clivage par PilD: sur Mutant G Dans pEpsGG-1V Pas de G-L, pas de clivage sur G nonfonctionnel, pas de sécrétion Clivage EpsG par PilD est nécessaire au cross-link avec EpsL

Lien direct/indirect 1. Rôle des autres membres T2S….??? Seule EpsL est essentielle à la formation G-L EpsL EpsG Interagissent Directement

2. Rôle de Protéines spécifiques à V. cholerae….??? Immunoblott pour G G-L formé En présence de EpsG EpsL E. coli Aucune protéine de V.cholerae est impliquée G se lie de préférence à L qd L est présent

3. Rôle Protéines spécifiques à V. cholerae….??? Immunoblott pour L Association EpsG-EpsL spécifique

Effet Mutation T112, D91 de EpsG…??? Liaisons H Asp91-Thr112 G devient moins stable

Substitutions T112 D91de EpsG WT mutantG+Plasmides: Immunoblott pour EpsG Absence G-L si résidus G substitués (D91E, T112L) Pas de Sécrétion si Résidus substitués: domaines conservés Chez ts homologues

Conclusion

Apport de l’article…? EpsL: Scaffold transduction de signaux entre E-G ‘‘Linker’’ de l’ATPase:EpsE-EpsG: conversion énergie Etude interactions EpsG-EpsL cross-link (1pseudopilin Majeur-le reste duT2SS) L’hydrolyse ATP: Changement dynamique de E Qui affecte L Qui permet assemblage de G L’association EpsL-EpsG est spécifique: sans aucun autre composé T2SS. EpsG clivée par PilD devient mature et interagit avec EpsL. Etudes antérieures: Interactions entre les 5 pseudopilins Interactions EpsE-EpsL

Rôle des G,L,E dans la sécrétion de toxines (GSP) EpsD OM Pseudopilus Exportation de toxine Clivage PilD C filaments en Hélice M EpsL Peptidase PilD G G G Sec IM EpsF EpsE G T G ATP ADP +Pi G T G T G G The conversion of chemical energy to mechanical work: Polymérisation des G Pseudopilins G G

Sécrétion de toxine chez V. cholerae Piston

Futures Etudes.…? Déterminer le site précis d’interactions entre EpsG et EpsL. Déterminer le rôle des autres pseudopilins (H-K), sont ils ‘‘recrutés’’ eux aussi par EpsL par hydrolyse d’ATP? Pour être incorporer dans le pseudopilus. Comprendre réelement l’implication des interactions EpsG-EpsL (hydrolyse d’ATP et ???)

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