Apport de la génétique dans le cancer colo-rectal familial A. CHIKOUCHE, M. AIT-ABDALLAH, L. GRIENE et Y. OUKACI CPMC
Introduction Le Cancer Colorectal ou CCR est un problème de santé publique Représente ~13 % des cancers. 3ème cause de cancer chez l’homme et 2ème cause chez la femme dans certain pays, 2ème cause en Algérie. Son incidence augmente avec l’âge. Les facteurs à l’origine mal connus [alimentation (régimes riches en graisses animales) et le tabac]. Complique certaines pathologies: adénome colique, maladie de Crohn et rectocolite hémorragique. Formes héréditaires: cause génétique (prédisposition) Devant tout cas de CCR, une consultation d’oncogénétique est mise en route et des analyses moléculaires sont indiquées (l’analyse des microsatellites etc.…).
Cancer Colorectal Sporadique (~60%) Familial (~30%) Syndromes rares (~4%) HNPCC (3-5%) PAF (<1%)
Carcinogénèse
Formes familiales CCR familiaux sans adénomes Polypose adénomateuse Polypose adénomateuse familiale Gène: APC Sd de Lynch-HNPCC Gènes: MSH2, MLH1 et MSH6 Sd adénomes multiples (récessives) Gène: MYH CCR familiaux Sans mutation connues Prédispositions familiales
Polypose adénomateuse familiale ~ 1 % des cancers colorectaux. Due à des mutations du gène APC (adenomatous polyposis coli) Incidence 1 pour 10.000 100 à 1000 polypes (comptage par Chromoscopie ) Risque de 7% d’avoir un CCR à 21 ans et de 93% à 50 ans Peut se présenter sous une forme classique avec des: Manifestations malignes telles que les médulloblastomes, le cancer de la thyroïde, le cancer colique, des Hépatoblastomes. Manifestations bénignes telles que l’hypertrophie de l’épithélium pigmentaire de la rétine, des anomalies dentaires, des ostéomes de la mâchoire, des kystes épidermoïdes, des polypes glandulokystiques Tumeurs desmoides Ou sous une forme atténuée (très rare)
Gène et protéine APC Gène APC: localisé en 5q21, Suppresseur de tumeur Longueur de 120 Kb, Séquence de 8535 pb codée par 15 exons (15ème très important). Protéine: 310 Kd, 2843 AA
Rôles de la protéine APC Régulateur négatif de la voie Wnt / b-caténine , Dans l’organisation du cytosquelette par son association aux microtubules. Dans divers processus physiologiques de la croissance cellulaire à l'apoptose
Génétique de la PAF Transmission autosomique dominante: avec pénétrance complète (50% de risque d’être atteint si un parent est atteint) Due à des mutations du gène APC, retrouvées dans 90% des cas Inactivation du gène APC: Activation permanente de cette voie de signalisation Wnt avec augmentation de la prolifération cellulaire incontrôlée (cancer). Plus de 30% des patients ont des mutations germinales de novo Plusieurs familles ont des mutations uniques Dans la tumeur, selon l’hypothèse de Knudson , 1 mutation germinale + 1 mutation ou perte d’hétérozygotie (LOH). 9
Les mutations dans le gène APC Codon 1309 Codon 1061 5' 3' 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Prés de 1400 mutations. Petites délétions (majorité): protéine tronquée, Mutations faux-sens ou non-sens, petites insertions, grandes délétions, des mutations dans des sites d'épissage, de petites délétions /insertions, de grande insertions et des réarrangements et des mutations dans les séquences régulatrices. MCR (mutation cluster region) est entre les codons 1000 à 1600. Mutations: Délétion de 5 pb au codon 1061 (c.3183_3187delACAAA) et au codon1309 (c.3927_3931delAAAGA) = les plus fréquentes.
Fortes corrélation phénotype/génotype dans la PAF 11
Polypose récessive Nombre moyen des polypes = 55 Age moyen de diagnostic = 30-50 ans Due à des mutations du gène MYH ou MUTYH Gène MYH; 1p34.3-p32.1, 16 exons, 11147 pb Protéine: 1854 pb; 535 acides aminés, PM: 52 kDa Adénine glycosylase: Protéine impliquée dans le système « Base excision repair » (BER) ou réparation par l'excision de base Mutations = diminution de l’activité adénine glycosylase 30% des cas = mutations homozygotes (biallélique) : Y165C dans l’exon 7 et G382D dans l’exon 13 Mutations type faux-sens, non-sens, décalage du cadre et mutations d'épissage
Autres polyposes Syndrome de Peutz-Jeghers <1% de tous les cas de CCR Transmission autosomique dominante Présence de polypes Hamartomateux vers la 1ere décade Hyperpigmentation mucocutanées glt vues chez les enfants < 5 ans Risques de Cancer (colon, intestin grêle, estomac, pancréas, seins, ovaires, utérus, testicules, poumons, reins Mutations dans le gène STK11 (19p13.3), Code une protéine de la famille des sérine-thréonine kinases Retrouvées dans 70% des cas familiaux et 30-70% des cas sporadiques Polypose Familiale Juvénile 5 polypes juveniles ou plus dans le colon ou tractus gastrointestinal Apparaît au cours de la 1ére ou 2éme décade Risque de cancer gastrique, pancréatique Les gènes SMAD4/MADH4, (18q21.1 ) et BMPR1A/ALK3, (10q22-23) qui ont un rôle important dans la voie enzymatique du TGF, sont impliqués
CCR familiaux sans adénomes Le syndrome de Lynch ou syndrome HNPCC Maladie héréditaire à transmission autosomique dominante. Critères cliniques Critères d’Amsterdam-I Au moins trois sujets atteints de cancer du côlon confirmés histologiquement et dont au moins un est parent au premier degré des deux autres Les cas sont répartis sur au moins deux générations successives Au moins un des cas est diagnostiqué avant l'âge de 50 ans La polypose familiale est exclue Critères d’Amsterdam-II (Critères d’Amsterdam-I avec) cancer du spectre HNPCC restreint (côlon, endomètre, intestin grêle, voies urinaires) Critères de Bethesda-II Un second cancer colorectal synchrone ou métachrone ou autre tumeur du spectre HNPCC élargi (endomètre, intestin grêle, voies urinaires, estomac, ovaires, pancréas, voies biliaires, cerveau)
CCR familiaux sans adénomes Le syndrome de Lynch ou syndrome HNPCC Du à l’altération d’un des gènes qui participent au système de réparation des mésappariements de l ’ADN (MMR pour MisMatch Repair) Plusieurs gènes identifiés. MLH1; 3p21.3 (MutL homolog 1, 19 exons) MSH2; 2p22-p21 (MutS homolog 2, 16 exons) MSH6; 2p16 (10 exons), Autres gènes: PMS1 (2q31-33), PMS2 (7q22) et MLH3 ( 14q24.3).
Réparation des mésappariements
Les mutations dans le syndrome de Lynch MSH2 ~30% Inconnue ~30% MLH1 ~30% MSH6 (5 à 10 % ) Autres gènes (rare) Prés de 300 mutations dans MLH1 et dans MSH2 Type de mutation: Substitutions nucléotidiques (faux-sens, non-sens et des erreurs d'épissage) et les insertions / délétions (grandes ou petites). la protéine obtenue est tronquée. Hyperméthylation du promoteur de MLH1 Ces mutations sont hérités dans un allèle et plus tard l'autre allèle est perdue par LOH dans la tumeur. Ces gènes sont responsables d’une caractéristique tumorale appelée MSI (MicroSatellite Instability) ou phénotype RER (replication error).
Principe de l’instabilité des microsatellites. Microsatellites ou STRs (short tandem repeats) = séquences répétées, à localisation variable dans le génome Instabilité des microsatellites (MSI, microsatellite instability) se caractérise par la modification d’un grand nombre de séquences répétées dans le génome des cellules tumorales par rapport aux cellules normales d’un même individu. Découverte par hasard dans les années 1990.
Mécanisme du mésappariement - Principe général
Diagnostic génotypique
Recherche génétique dans la PAF Test proposé après conseil génétique, information et consentement éclairé. Une demande, un résumé clinique et un arbre généalogique Se fait sur un prélèvement de sang L’étude du gène APC peut confirmé un diagnostic suspect. Les membres de la famille avec une mutation connue bénéficie de la recherche spécifique de cette mutation La recherche de la mutation chez les enfants à risques pour la PAF peut être envisagée avant de commencer le screening du colon.
Stratégie d’étude génotypique dans le cas de la PAF Clinique Dominante Récessive Séquençage MYH (14 amplicons) Séquençage APC (31 amplicons) Etude des exons selon la clinique Sinon commencer par l’exon 15 + Mutation + - Mutation Pas de Mutation Enquête familiale, surveillance, prise en charge des porteurs de la mutation - Recherche de réarrangement MLPA + Surveillance familiale digestive
Recherche génétique dans le syndrome HNPCC Une demande avec un résumé clinique Un arbre généalogique Une fiche de consentement Prélèvements Prélèvements de tumeurs Prélèvement de sang
Stratégie d’étude génotypique dans le cas du CCR Critères d’amsterdam ou de Bethesda + - Etude génétique (consentement) Etude génétique non faite (Tumeur) Statut MSI - + Recherche de la V600F (BRAF) MSS + MSI Cancer sporadique avec hyperméthylation de MLH1 IHC (MLH1, MSH2) (Sang) Séquençage MLH1 (19 a), MSH2 (16 a) et MSH6 (19 a) Arrêt de l’étude + - Mutation Pas de Mutation - Recherche de réarrangement MLPA Enquête familiale, surveillance + Autres gènes ?
Étude des microsatellites Entité MSI (microsatellite instability ou instabilité des microsatellites)
L’analyse MSI Test positif = perte de la fonction du système de réparation des mésappariements (MMR) dans des tumeurs et qui conduit au cancer. 95% des tumeurs HNPCC sont MSI+ 10%–15% des cancers sporadiques sont MSI+
L’analyse MSI Intérêts: Tumeur avec statut MSI positif = forme familiale Tumeur avec statut MSI positif = meilleur pronostic. Adaptation du traitement adjuvant (5 fluouracile et d’acide folique) efficace pour les tumeurs dont le phénotype est stable. inefficacité chez les malades ayant une tumeur MSI+.
L’analyse MSI Indication: Recherche de MSI chez tout CCR avant l’âge de 60 ans. Etude par amplification de microsatellites sur des prélèvements de tumeurs (tissus frais, congelé ou coupes en paraffine). Technique réalisée par analyse de fragments.
L’analyse MSI Protocole pour l’analyse MSI La technique est basé sur la migration éléctrophorétique de produits PCR marqué par des fluorochromes dans un capillaire (séquenceur). On utilise un standard interne pour mesurer les tailles des fragments obtenus. Protocole pour l’analyse MSI Extraction de l’ADN à partir de tumeur Amplification Préparation du mélange PCR Analyse de fragment par séquençage
Mise en évidence d’une MSI (phénotype RER) 5 marqueurs microsatellites (poly A ou T) utilisés ADN normal: 1 marqueur: 1 bande normale ADN tumoral: 1 marqueur: La bande normale + autres plus petites Petite bande: délétion: instabilité des microsatellites 3 ou plus de marqueurs instables (≥ 3 marqueurs/ 5) = MSI positif 0, 1 ou 2 marqueurs instables = MSI négatif ou MSS.
Exemple de résultats MSI
Protocole pour Séquençage Extraction d’ADN à partir du sang Amplification PCR Préparation du Mix PCR Migration électrophorèse Photo Visualisation des bandes d’ADN PCR de séquence Purification Electrophorégramme Purification Séquençage
Amplification d’ADN par la PCR Mullis, Prix Nobel 1993 But: Obtenir une quantité d’ADN suffisante pour les analyses futures. Principe: augmentation du nombre de copies d’ADN Répétition des cycles (30) Quantité de copie 230
La réaction de séquence Après purification des produits PCR Principe (méthode de Sanger: Consiste à faire synthétiser un brin d’ADN qu'on désire séquencer en prenant comme matrice le brin complémentaire par une ADN polymérase, avec une incorporation aléatoire de didésoxynucléotides qui bloquent la synthèse. Chaque type de ddNTP porte un fluorochrome spécifique (nombre 4). les produits de la réaction de séquence purifiés sont déposés sur un séquenceur ABI Prism 3130 où ils sont séparés par électrophorèse capillaire. Les différents fragments, une fois séparés, sont détectés par émission de fluorescence après excitation par une source lumineuse. L’électrophorégramme (séquence) obtenu est comparé à la séquence de référence.
Exemple de résultats de séquençage Mutation de MLH1: insertion de 2 nucléotides CA
La MLPA Multiplex Ligation Probe Amplification Amplification simultanée de séquences-sondes hybridées sur des séquences ADN cibles spécifiques en une seule réaction PCR multiplex Méthodes de détection des changements du nombre de copie de séquences d’ADN ou de simples exons .
Exemple de résultats par MLPA Sain Patient Délétion des exons 1-6
Intérêts de l’étude des gènes BRAF et KRAS dans le CCR EGFR et son ligand type sauvage Utilisation d’un anti EGFR Mutation du KRAS et Mutation du BRAF = activation constitutive de la voie EGFR (indépendante de la fixation du ligand à son récepteur), en aval du récepteur.
Mutations du gène BRAF et CCR BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) 7q34 , 18 exons , 190284 bp Protéine codée par 2478 bp, 766 acides Amines, PM: 84436 d. Famille des gènes RAF codant pour des kinases régulées par les gènes Ras et impliquées dans la réponse cellulaire aux signaux de croissance. Mutations impliquées dans d’autres cancers (thyroïde) La présence de mutation du gène BRAF est corrélés à l'absence de réponse au traitement par des thérapies anti-EGFR. La mutation V600E (pour certains auteurs, V599E) dans l’exon 15 est associée au statut MSI positif dans environ 40 % de tumeurs coliques sporadiques (mais, non au syndrome HNPCC) mais mécanisme en cause non connu. Cette mutation serait étroitement corrélée à l’hyperméthylation du gène MLH1 et donc à l’absence de son expression.
Mutations du gène KRAS et CCR KRAS localisé 12p11.22 est un oncogène (Kirsten Rat Sarcoma virus). Six exons, taille 35kb La protéine KRAS de 21KD, localisée sur la face interne de la membrane plasmatique et possède une activité de GTPase, est une composante essentielle de la cascade de transduction du signal en aval du récepteur membranaire EGFR Mutations somatiques détectées dans des cancers (poumon, colon, pancréas et thyroïde). Mutations activatrices, retrouvées dans environ 30% des CCR. Essentiellement associées à un cancer du côlon sans instabilité de microsatellites Les mutations les plus fréquentes sont détectées dans les codons 12 (~82% des mutations KRAS) et 13 (~17%) de l’exon 2 du gène KRAS. Présence d’une mutation = absence de bénéfice clinique aux traitements anti-EGFR tels que les anticorps monoclonaux anti-EGFR (cetuximab et panitumumab).
Conclusion Le diagnostic des prédispositions aux CCR nécessite une collaboration étroite entre les différents intervenants (médecin traitant, gastroentérologue, biologiste, chirurgien et oncologue). L’identification des formes héréditaires des cancers colorectaux est nécessaire à la bonne prise en charge adaptée des malades et de leur famille et les moyens de prévention sont possibles et efficaces. L’absence de reconnaissance de telles formes met en jeu le devenir non seulement des malades mais aussi de leurs apparentés. L’étude génétique apporte une aide précieuse mais doit être orientée par une bonne clinique et un diagnostic anatomopathologique poussé (immunochimie)
Merci