Un pathogène d’actualité

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Transcription de la présentation:

Un pathogène d’actualité Maubeuge FMC 09/11/2006 Clostridium difficile Un pathogène d’actualité Dr Levent: Équipe opérationnelle en hygiène - référent en antibiothérapie. CHSA Manica Vasseur: Laboratoire de biologie. CHSA

2. Diagnostic Bactériologique Manica Vasseur – Biologiste Laboratoire. CHSA La bactérie : caractéristiques et facteurs de virulence Le diagnostic bactériologique État des résistances

2. Caractéristiques de la bactérie Bacille Gram Positif anaérobie strict Spore subterminale peu déformante Souches:  toxinogènes (pathogènes)  non toxinogènes (non pathogènes) Toxine A:entérotoxine Toxine B: cytotoxine

2. Caractéristiques de la bactérie La Toxine A induit: une inflammation importante Une infiltration massive de la muqueuse intestinale par des polynucléaires et des cellules mononuclées Une nécrose de l’épithélium intestinal Une accumulation de fluide dans l’épithélium intestinal

2. Caractéristiques de la bactérie La Toxine B : 1000 fois plus puissante/toxine A. Elle est cytotoxique induit un effet cytopathogène (rétraction cellulaire, dépolimérisation des filaments d’actine du cytosquelette Induit une augmentation de la perméabilité de la muqeuse intestinale

2. Caractéristiques de la bactérie Les toxines A et B agissent en synergie Distinction classique Toxine A/Toxine B n’est pas aussi tranchée. Les 2 toxines sont dotées de propriétés cytotoxiques et entérotoxiques (Savidge et coll 2003) Polypeptides de grandes tailles (308 et 270 Kda) présentant toutes 2 des structures primaires similaires Joueraient un rôle dans l’adhérence bactérienne (Tasfeyne et coll-2001, Borriello et coll-1998) Domaine transmembranaire intervenant dans la translocation des toxines dans le cytosol Domaine N terminal Activité enzymatique toxique Site de liaison aux cellules cibles

Mécanisme d'action des toxines Actions indirectes Action directe Induction de Liaison aux récepteurs des entérocytes Production de cytokines proinflammatoires par les monocytes (TNF  , IL1 ,et 6) et les entérocytes (MIP 2, IL8 ) L'apoptose de certaines cellules intestinales Internalisation Inactivation des proteines Rho Infiltration massive de polynucléaires activés Désorganisation du cytosquelette cellulaire Nécrose des cellules coliques Augmentation de la perméabilité paracellulaire Inflammation sévére Destruction des cryptes intestinales Lésions épithéliales Pseudomembranes : PN , fibrine , débris cellulaires Diarrhée aqueuse

2. Caractéristiques de la bactérie Autres facteurs de virulence: Facteurs d’adhésion Structures spécifiques favorisant la persistance de la bactérie dans le tube digestif continuellement lavé par les fluides intestinaux  Structures d’adhésion au mucus: flagelles ou Fumbriae  Structures d’adhésion aux cellules hôtes: prteines de la couche S, Adhésine Cwp66, Proteine Fbp68

2. Caractéristiques de la bactérie Autres facteurs de virulence: Enzymzes hydrolytiques (gélatinases, hyaluronidases…)  facilitent le maintien de la bactérie dans le tube digestif  Les souches les plus virulentes sont les plus protéolytiques dans les modèles animaux.

Autres facteurs de virulence Sécrétion d'autres toxines Toxine binaire ( ADP ribosyl- transférase spécifique de l'actine ) Dépolymérisation de l'actine Ballonisation des cellules Aurait un rôle dans la virulence de souches particuliéres

2. Réponse immunitaire de l’hôte La production d’anticorps (IgG anti-toxine A notamment) serait protectrice Une bonne réponse humorale pourrait assurer une bonne protection contre les récidives (Kyne et coll- Lancet 2001)

Facteurs de virulence et réponse immunitaire Le degré de virulence de chaque souche et les différents niveaux de réponse de l'hôte pourraient expliquer les présentations cliniques très variées observées

Le diagnostic biologique : Principes d’utilisation des tests Respect des indications : Patients diarrhéiques Facteurs de risque : antibiothérapie < 4 s ( la durée de l'antibiothérapie majore le risque ) ou hospitalisation récente , chimiothérapie , laxatifs , stimulants gastro- intestinaux, tous les facteurs modifiant l'écosystéme ou la motilité intestinale ) Test non effectué sur selles solides sur écouvillon Quantité de selles suffisante (au minimum 3 ml ) Généralement un seul prélévement suffit Inutiles chez les patients asymptomatiques Test de contrôle pendant ou après le traitement non recommandé Un test positif sans diarrhée ne nécessite pas de traitement (portage sain)

Taux d’isolement de Clostridium difficile

Diarrhées post antibiotiques : d'autres responsables ? Staphylococcus aureus Candida Clostridium perfringens Klebsiella Oxytoca

4. Le diagnostic biologique Selles Mise en évidence des toxines Mise en évidence de Clostridium Difficile Elisa Cytotoxicité PCR Isolement Dépistage de l'antigéne Ag GDH

- Recherche de l'Effet cytopathogéne Mise en évidence des toxines dans les selles - Recherche de l'Effet cytopathogéne - Recherche des toxines - Recherche par PCR

La technique de référence :Culture cellulaire Recherche d' un effet cytopathogène de la toxine B Après dépôt d’un filtrat de selles sur les cellules L’ECP correspond à une ballonisation des cellules Sensibilité 80-90% Spécificité 100% Infrastructure lourde requise

En France : 1 à 3% des souches sont Toxine A- B+ Recherche de toxines Test Elisa ou immunochromatographiques utilisant des anticorps monoclonaux dépistant -la toxine A -ou les toxines A et B En France : 1 à 3% des souches sont Toxine A- B+ Technique rapide : environ 30 minutes Limites des tests : Spécificité > 97% Sensibilité : 52- 95% (100- 1000 pg de toxines) Faux négatifs

Techniques de biologie moléculaire La PCR : Amplification génétique  Sensibilité (91 à 97%) Spécificité : 100%  Nécessitant un équipement particulier :non réalisable dans les laboratoires classiques  Problème de fiabilité : présence d’inhibiteurs de la réaction dans les prélèvements Techniques de PCR en temps réel :  Plus rapides et plus fiables  Réalisable dans tous les laboratoires  En développement  Problème de côut

Mise en culture Ensemencement d'une suspension de la selles sur un milieu contenant: des inhibiteurs: Cyclosérine Céfoxitine du Taurocholate : permettant la germination de spores ( augmente la sensibilité de la culture ) Incubation en anaérobiose stricte 48-72 h à 37°C

Aspect en culture Colonies circulaires à bords irréguliers (3-5 mm), non hémolytiques - présentant un aspect de verre fritté - odeur caractéristique de crottin de cheval - colonies fluorescentes sous UV

Identification Equipement enzymatique : Rapid 32A ( bioMérieux ) Inoculum lourd (4 - 5 McF )

Importance de la culture Manque de sensibilité des tests de recherche de toxine 10 % des infections à Clostridium Difficile ne seraient dépistées que par la culture

Recherche de toxinogénicité de la souche isolée Typage des souches recues au CHSA Méthodes génotypiques : PCR-ribotypage Toxinotypie Recherche de toxinogénicité de la souche isolée

Typage des souches Méthodes génotypiques : PCR-ribotypage Toxinotypie Marqueurs de différenciation des souches isolées En période épidémique Démonstrer l'existence de contamination croisée entre patients hospitalisés Analyse des souches en circulation Suivi de l'émergence de nouveau variants Différencier une rechute d'une réinfection en cas d'isolement répété d'un Clostridium Difficile chez un même patient

4. La sensibilité aux antibiotiques En pratique courante, les études de sensibilité sont rarement effectuées En effet: ► les traitements habituels sont toujours efficaces (pour l’instant) ► ATBgramme standard (par diffusion en gélose) mal adapté aux anaérobies stricts

Antibiotiques incriminés Fréquemment : Clindamycine, Lincomycine, Amoxicilline, Augmentin Céphalosporines, Bactrim Moins souvent: Macrolides, Phénicolés, Quinolones, Cotrimoxazole, Rifampicine,Tétracyclines Jamais Aminosides

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (2) Céphalosporines Céfoxitine Moxalactam Fluoroquinolones Résistance naturelle Amoxicilline Pipéracilline Imipénème Glycopeptides Imidazolés Erythromycine Tétracycline Rifampicine Chloramphénicol Habituellement sensible

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (3) La vancomycine et le métronidazole sont les molécules les plus fréquemment prescrites ► 3 souches Vanco-R (Dworczynski 1991) ► 3%Souches toxinogénes Vanco-I (Pelaez 1998 ► 11% (49/469) de souches R (Pelaez 1998) ►6%Souches toxinogénes metro cmi > 32 ( 415 isolats )(Pelaez 2000) ► 3% de souches non toxinogénes I (Barbut 1999) Vancomycine Métronidazole Vancomycine: 0,25-4 mg/l Métronidazole: 0,25-1 mg/l CMI

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (1) Rares études disponibles sur la fréquence des résistances % de résistance de C.difficile aux ATB 23,7 64,2 23 14,5 11,6 - 7,5 8 6 18,5 22,7 9,7 Tetracyclines Erythromycine Rifampicine Chloramphénicol Barbut 1999 Niyogi 1992 Levett 1988 Delmée 1988

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (4) Mécanismes et supports génétiques des résistances Chromosomique transférable (altération du ribosome) Chromosomique transférable (modification du ribosome) Inactivation enzymatique Macrolides Tétracyclines Chloramphénicol Mécanismes de résistance Antibiotiques

Sensibilité de C.difficile aux quinolones Ofloxacine , Ciprofloxacine: CMI 8 à 16 mg/l Levofloxacine : CMI 4 à 8 mg/L Moxifloxacine : cmi plus basses : 0,5 à 2 mg/l Résistance à la moxifloxacine 12% : étude Allemande ( 1986-2001)

Sensibilité de C.difficile au linézolide Cmi des souches sensibles : 0,03 à 4 mg/l Des souches résistantes ont été décrites : Ackerlman et Coll en 2003 : 23 souches de sensibilité diminuée sur 192 isolats Résistance associée aux fluoroquinolones et macrolides