Plate-forme de Recherche Clinique en CYTOMIQUE Biomarqueurs cellulaires innovants CPER : Innovations thérapeutiques et Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B) Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (Pr F Plenat) dédié à la recherche clinique et translationnelle Mutualisation des compétences Complémentarités humaines et technologiques Ouverture régionale et interrégionale Ensemble type « Flow cytometry core facility » Cytométrie en flux multiparamétrique Cell Search Veridex Image Stream System (Amnis) Une démarche commencée en 2005!

Cytométrie de flux multiparamétrique Navios (Beckman Coulter) Software Kaluza CMF 3 lasers 10 couleurs <… 5 Laboratoire dImmunologie (Pr GC FAURE, Pr MC BENE, Dr M de CARVALHO) Service dHématologie biologique (Pr T LECOMPTE, Dr V LATGER) Unité de thérapie cellulaire et tissulaire (Pr JF STOLTZ, Pr A DALLOUL) Anatomopathologie (Pr F PLENAT, Dr K MONTAGNE)

Cancéropole Cytométrie de flux multiparamétrique Evénements rares et populations discrètes… après « single platform » et Onco-Hématologie NoE European Leukemia Net STIC DHOS Maladie résiduelle (LAL, LAM) Maladie Résiduelle LLC Myélodysplasies Projet INCA SIGLAM Phase périphérique des LMNH Réponse immunitaire anti-tumorale et thérapie cellulaire Tregs, cellules dendritiques, cellules NK Production cytokiniques spécifiques dAg Microparticules et cellules endothéliales

Cytométrie de flux multiparamétrique (2) MC Béné, au nom du GEIL, GTLLF, GOELAMS Moelle normale Maladie résiduelle valorisation démarche détection et quantification dévénements rares au sein des « bermudes » CD34 CD45 CD13SSC

Publications récentes Four- and five-color flow cytometry analysis of leukocyte differentiation pathways in normal bone marrow: a reference document based on a systematic approach by the GTLLF and GEIL. Four- and five-color flow cytometry analysis of leukocyte differentiation pathways in normal bone marrow: a reference document based on a systematic approach by the GTLLF and GEIL. Arnoulet C, Béné MC, Durrieu F, Feuillard J, Fossat C, Husson B, Jouault H, Maynadié M, Lacombe F. Cytometry B Clin Cytom Jan;78(1):4-10. How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European LeukaemiaNet. How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European LeukaemiaNet. Béné MC, Kaeda JS. Haematologica Aug;94(8):

ELN net.org/content/diagnostics/diagnostics/morphology Consensual Documents provided by WP10 Created by: M.C. Béné, generated 2008/01/12, last changed: 2008/04/22 …. useful for the immunophenotypic diagnosis of leukemias by flow cytometry. Flow cytometry atlas Created by: F Lacombe, C Arnoulet, F Durrieu, J Feuillard, C Fossat, B Husson, H Jouault, M Maynadié, MC Béné, generated 2008/07/12, last changed: 2009/01/04

Cytométrie de flux multparamétrique (2) Réponse immunitaire anti- tumorale spécifique (M de Carvalho, P Eschwege + …) Antigènes candidats (cancer prostate) Problématique: événements rares + caractérisation multiparamétrique phénotypique et fonctionnelle de sous populations cellulaires Signatures cytokiniques Transfert de lexpérience acquise dans la réponse spécifique anti-mycobacterium tuberculosis et anti-adenovirus

Cytométrie de flux multiparamétrique (3) Microparticules, thrombose et cancer (V Latger- Cannard, Th Lecompte) Standardization of platelet-derived microparticle counting using calibrated beads and a Cytomics FC500 routine flow cytometer: a first step towards multicenter studies? Standardization of platelet-derived microparticle counting using calibrated beads and a Cytomics FC500 routine flow cytometer: a first step towards multicenter studies? Robert S, Poncelet P, Lacroix R, Arnaud L, Giraudo L, Hauchard A, Sampol J, Dignat- George F. J Thromb Haemost Jan;7(1): Epub 2008 Oct 18.

Projets en cours Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) (V Latger, MC Béné) Déficit en molécules GPI-linked Lymphocytoses B (JF Lesesve, MCB) SIGLAM (MCB - INCA) Activation intracellulaire Septiflux recherche translationelle Inserm (J Feuillard Limoges, S Gibot et Immuno Nancy) Marqueurs lymphoïdes et monocytaires

Cell Search Veridex® Combinaison de méthodes Immunologiques spécifiques Séparation immunomagnétique Quantification en imagerie photonique automatisée Standardisation et automatisation de la phase préparative Très grande sensibilité (5 évts/tube de 7,5mL) soit #10-7 outil de choix pour l'étude des cellules endothéliales circulantes en recherche clinique. Validation antérieure en recherche clinique pour les cellules tumorales circulantes pour des études pronostiques. Capacités disolement des cellules en vue détudes moléculaires complémentaires

Projets Cell Search Cancéropole et au-delà… Cellules Tumorales Circulantes (CTCs) Sein (CIC Cancérologie CHU-CLCC E Luporsi – GSK/NOVARTIS – INCA?) Poumon AO Cancer 2009 Région Lorraine, Nancy Y Martinet, JM Vignaud comparaison ISET STIC Nice, Strasbourg P Oudet, M Beau-Faller Prostate (Nancy Urologie: J Hubert, P Eschwege; Paris: S Loric LIBM) Validation clinique en réseau interrégional, national, voire européen (IMI?) Cellules Endothéliales Circulantes (CECs) Thérapies antiangiogéniques Inflammations: sepsis (CPRC S Gibot) Neuroectodermoses: Sclérose tubéreuse de Bourneville (J Hubert, Necker)

Résultats littérature Stratification Baseline levels predicts outcome Changes predicts survival

Cell search CTCs (1) CERONC – Poumon (Y Martinet, E Quoix, M Beau-Faller, P Oudet) Evaluation de lintérêt clinique de la détection des cellules tumorales circulantes dans le cancer bronchique métastatique Avec ajout de marqueurs dintérêt (EGFR, X) Isolement des cellules en vue détudes moléculaires CERONC – Prostate (P Eschwege, J Hubert, D Peiffert) Evaluation préthérapeutique

Autres projets CTCs Cancer Poumon Projet CIRCUBRON C Clement Duchene Cancer ORL Collaboration CAV: G Dolivet, R Mastronicola Dilution limite B Faivre: Thrombose, Hémostase et Cancer ORL

Cell Search CECs (2) Projet Sepsis CPRC CHU Nancy (Pr S Gibot, GCF) Quantification des CEC Isolement des CECs pour études moléculaires Projet STB (Sclérose Tubéreuse de Bourneville) Evaluation des CECs comme biomarqueurs dangiogénèse pour lévaluation et le suivi des tumeurs vasculaires rénales Demande en cours ASTB, PHRC maladies rares (GCF, Pr J Hubert, Necker – D Joly, Lyon – O Rouvière)

Sepsis…. STB Résultats préliminaires Collaboration Bordeaux Sepsis (CPRC) C3, B2 Suivi séquentiel

Autres projets CECs Hémangiomes (propranolol-6) Maladie Rendu-Osler Vascularites (10) Suites infarctus (<20) Anévrysmes aortiques? Eclampsie (2) Thérapeutiques anti-angiogéniques (12)

Imagerie en flux Image stream X AMNIS® Le système AMNIS®, système dimagerie en flux combinant cytométrie en flux et imagerie photonique Observation directe, de la localisation précise, cellule par cellule, des marqueurs fluorescents utilisés pour identifier: membrane, organites intracellulaires, noyau. Parmi les applications réalisables en simultané Marquages membranaires multiples et colocalisation de marqueurs de surface Marquages nucléaires (FISH en suspension) Translocation nucléaire, Apoptose Etudes fonctionnelles Coopérations cellulaires (synapse immunologique)

Image stream X AMNIS Applications…. etc Biologie cellulaire – Immunologie Cancérologie Cycle CellulaireSignalisation CellulaireAnalyse MorphologiqueMort cellulaireDommage de lADNInteractions cellulaires

Spectral decomposition element detector laser brightfield illuminator cells in flow velocity detector autofocus Spectral decomposition element detector laser brightfield illuminator cells in flow velocity detector autofocus ImageStream Layout

UntreatedMCP MCP-1Untreated Shape Change, Primary Monocytes Circularity = average radius divided by radial variance MCP-1 causes a loss in circularity in the majority of the monocytes

Monocytes T cells NF-kB translocation in whole blood subsets

Example: NF-kB translocation assay in monocytes LPS stimulated cell, low translocation LPS stimulated cell, high translocation

Incubate PBMC with CpGB Label pDC with BDCA PE, CD71 or CD107a FITC Quantify: Internalization and colocalization of CpGB to endosomes and lysomes Internalization / trafficking in primary cells Collect 20,000 event image files on the ImageStream Chongwei Cui Dr. Pat Fitzgerald- Bocarsly UMDNJ

T cell / APC interactions Identification of molecular recruitment to the immune synapse. Dr. Brandon Burbach University of Minnesota

ImageStream: Standard Imaging Cells exhibit common artifacts associated with defocus making spot counting difficult Jurkat cells probed with ChrX (Spectrum Green) and Chr8 (Spectrum Orange) ImageStream: Extended Depth of Field Imaging Same sample (different cells) with WFC element. FISH spots maintain size independent of focal position within nucleus EDF – FISH analysis

Cell Cycle / Mitosis / Apoptosis ProphaseMetaphaseAnaphaseTelophaseInterphaseAtypical HL60 cells were labeled with anti-HLA AF488 and DRAQ5 DNA condensation pattern and Brightfield contrast help distinguish the phases of mitosis from apoptotic and interphase nuclei CV= 4.0 Apoptotic

Plate-forme de recherche clinique en CYTOMIQUE Biomarqueurs cellulaires innovants CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B) Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (REDIF: Pr Th Lecompte; CIC-B Pr GC Faure) dédié à la recherche clinique Ensemble type « Flow cytometry core facility » Cytométrie en flux multiparamétrique Cell Search Veridex Image Stream System (Amnis)