Compter des Microorganismes

Méthodes Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs

Nombre le Plus probable: NPP Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon

Nombre le Plus Probable (NPP) Commencer avec un bouillon pour déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes -1 -2 -3 -4 -5 -6 Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque Dilution dans chaque Tube Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

NPP- Suite Les résultats Objectif est de DILUÉ à zero l’organisme -1 -2 -3 -4 -5 -6 3 3 2 1 0 0 - No de tubes (+) Objectif est de DILUÉ à zero l’organisme Choisir la série la moins dilué qui sont tous négatifs Dans cet exemple (-5) Obtenir les résultats des 3 dilutions précédente Dans cet exemple (-2, -3, et -4) Determiner le nombre de tubes positifs pour chacune de ces dilutions Dans cet exemple (3, 2, 1 respectivement) Determiner le NPP sur le tableau de NPP

NPP = 1.5 UFC/ml pour la dilution 10-3

NPP Calculs Si 3, 2,1 Donc le résultat est: 1.5/ml or g Puisque ceci est une estimé pour la dilution de 10-3 nous devons multiplier par 1 000 Notre résultat 1.5 UFC/g ou ml 1.5 x 103 UFC/g ou ml

Comptes Directes L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

Comptes sur Hémacytomètre Cette lame possède 2 cellules de comptages indépendantes, chacune d’un volume de 0.1 mm3 quand elles sont recouverte d’une lamelle

Application à la Lame d’Hémacytomètre Remplir la cellule avec la suspension a être compté Laisser la cellule se remplir par capillarité Ne pas forcer le remplissage avec de la pression Lamelle

Déterminer le Compte Direct Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants 8, 8 et 5 Déterminer la moyenne (8 + 8 + 5)/3 =7 Donc 7 cellules/carré

Déterminer le Compte Direct (suite) 1mm Depth: 0.1mm 1mm Calculer le volume d’un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

Avantages: Limitations: Rapide Culture pas nécessaire Aucune info préalable nécessaire Limitations: Ne distingue pas vivant de mort Difficile de distinguer bactéries de détritus

Problème Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la cellule de comptage possède 100 carrés?

Microscopie Colorations

Coloration Différentielle Coloration de Gram Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives

Gram Positives Colorées Bleu Bacille Coccus Genres Bacillus et Clostridium Coccus Genres Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

Gram Négatives Colorées Rouges Bacille: Coccus: Genres Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. Coccus: Genres Neisseria, Pneumococcus et Meningococcus

Paroi Cellulaire Gram + Vs Gram - Paroi Peptidoglycane Membrane Couche de Lipopolysaccharide Absente Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique

Méthode - Coloration Primaire + Coloration avec le cristal violet Ajout d’iode de Gram (Mordant) + + Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif

Méthode - Étape Différentielle Lavage à alcool Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique + + Gram positif Gram Négatif

Méthode - Contre Coloration + Coloration avec la Safranine + + Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique + Gram positif Gram Négatif

Sommaire Fixation Coloration primaire Violet de cristal Lavage Décoloration Contre coloration Safranine

Coloration Acido-Alcoolo-Résistante Coloration diagnostique de Mycobactérium Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre Paroi cellulaire avec acide mycoïque

Méthode Principe: Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur Coloration avec de la fuchsine basique Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de l’alcool acide Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant

Coloration de Spores Spores: Cellule bactérienne différentiée Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à l’endospore

Coloration au Vert de Malachite Spores Sporangium Endospore Cellules végétatives Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine