Site en cours de construction Opération Biopuces Resp : Pr. J.R. Martin Site en cours de construction Version du 15/12/2003

Axes de recherche du groupe Biopuces Fonctionnalisation & optimisation des supports Conception & réalisation de biopuces Puces à oligonucléotides Puces à protéines Mise en oeuvre des biopuces Nouvelles méthodologies

Fonctionnalisation & optimisation des supports Chimie de surface sur support verre ou silicium silice Silanisation et fonctionnalisation pour : - Immobilisation des oligonucléotides - Synthèse in situ Approche physicochimique Approche physique

Conception, fabrication & mise en œuvre de biopuces Sélection de sondes par bioinformatique Développement des protocoles de matériel biologique Fabrication de puces de validation par synthèse in situ Lecture dynamique de puces à ADN Deux applications : Génotypage Expression de gènes

Outils informatiques pour la conception, l’analyse et la validation expérimentale de biopuces de génotypage Conception automatisée de séquences sondes pour le génotypage sur puce Analyse d’image pour l’interprétation de biopuces de génotypage

Puces à oligonucléotides (1/5) Le groupe Biopuces développe depuis 1997 des procédés de fabrication de puces à oligonucléotides par microprojection de réactifs. Deux échelles réactionnelles : 5 nanolitres, 3 picolitres Deux procédés : Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide

Puces à oligonucléotides (2/5) Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques Dispositif expérimental ½ Batterie avec 128 moyens de microprojection Grande vitesse de fabrication (50 puces/h) Absence de contamination Fabrication de puces à ADN pour le diagnostic : production de masse

Optimisation de la densité de greffage des sondes / processus d ’évaporation d’une goutte projetée : nano-mouillage T ambiante : 22.5°C Humidité : 43%RH

Puces à oligonucléotides (3/5) Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiques basse à moyenne intégration Dispositif expérimental Chimie des phosphoramidites Projection des nucléotides (5nl) Fabrication rapide et flexible de puces en quelques exemplaires : conception de biopuces, mise au point de protocoles biologiques

Puces à oligonucléotides (4/5) Synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques par la voie des phosphoramidites : adaptation du cycle de synthèse Couplage localisé par microprojection de la base et de l’activateur Autres réactions non localisées par microfluidique Réacteur anhydre et saturé en solvant

Puces à oligonucléotides (5/5) : synthèse in situ haute intégration Dispositif expérimental en cours de développement Chimie des phosphoramidites Projection des nucléotides (3 picolitres)

Biopuces pour la protéomique (1/2) Fixation contrôlée de peptides sur support plan : peptides synthétiques fixés par couplage covalent orienté sur support Objectif : réalisation d’édifices dendrimériques Applications : Reconnaissance de protéines pour diagnostic immunologique Programmes : CNRS “Protéomique” ; Région RA ”Méthodologies analytiques” ; Partenaires Rosatech, Université Lyon I (LBASB, LBCP), EFS, Protéine’Xpert solvant Peptides fixés Peptides non activés Objectif : immobilisation de dendrimères peptidiques Validation de la chimie de couplage (fluorescence, IR)

Synthèse « in-situ » localisée d’oligopeptides Biopuces pour la protéomique (2/2) : Synthèse « in-situ » localisée d’oligopeptides Schéma de couplage Synthèse des Fmoc AA -Fmoc Activateur (DCC) Etape 1 Rinçage Etape 2 Déprotection du Fmoc Etape 3 Etape 4 N-alpha-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-Alanine O n NH2 Principe: adapter le procédé de synthèse in situ de biopuces du LEOM à la chimie des Fmoc

Nouvelles méthodologies Optimisation de l’hybridation des biopuces : micromélange & microfluidique, étude cinétique des interactions cibles/sondes sur support solide Lecture dynamique des puces à ADN Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées Etude du comportement de biomolécules sur support solide Biocapteurs

Etude du comportement de biomolécules sur support solide Analyse cinétique de reconnaissance entre biomolécules Détection de SNP sur support solide : discrimination de deux cibles à un nucléotide prêt fluorescence Position X

Biocapteurs d’ADN Cartographie d’impédance optoélectrochimique pour la reconnaissance biomoléculaire

Principaux programmes de recherche 2003 Outils de conception et de fabrication de biopuces pour la protéomique, Programme de Recherche Région Rhône-Alpes, Thématique Prioritaire : Sciences Analytiques Appliquées (2003/2005) Puces ADN : étalement de gouttes avec évaporation et mécanismes réactionnels, modélisation mathématique et numérique, PIR CNRS : Microfluidique et Microsystèmes fluidiques (2003/2004) Micro-mélangeur à advection chaotique pour une hybridation optimisée des biopuces, FITT (2003/2004) 2002 Puces à ADN pour le diagnostic génétique, Programme GENHOMME (2002/2004) Conception et Validation d’une biopuce à PNA pour la traçabilité génétique des agents pathogènes, développement de l’équipement d’analyse associé, Programme MENRT (2002/2004) Autofluorescence & système moléculaire autofluorescent pour l'étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées, ACI Nouvelles méthodologies analytiques et capteurs (2002/2004) Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (“Multiple Antigen Peptide”), Programme CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003) Micro-mélangeur à advection chaotique pour l’hybridation des biopuces, Bonus Qualité Recherche 2002 (2002/2003) 2001 Machine de production de puces à ADN 256 sondes par microdéposition, Programme ANVAR de transfert de technologie (2001/2003) Réalisation d’une puce à ADN pour l’étude du transcriptome de Buchnera Aphidicola, Bonus Qualité Recherche 2001 (2001/2002)

Principaux programmes de recherche 2000 Projet ROSA2 (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme Puces à ADN du CNRS (2000-2002) 1999 Faisabilité d'un réacteur pour la fabrication de réseaux d'oligonucléotides par synthèse chimique parallèle localisée par microdéposition, Programme CNRS MICROSYSTEMES (1999/2000) 1997 Projet ROSA (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme GENOME du CNRS (1997-2000)