La transgenèse chez la souris Partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte = transgenèse additive Partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte Partie 3 Souris transgéniques générées par chimères d’agrégation

Qu’est-ce que la transgenèse? Animal transgénique: animal dont le génome a été modifié -soit par l’addition de nouvelles séquences d’ADN dans son génome avec une intégration aléatoire -soit par la modification de séquences déjà présentes dans son génome (knock-out, knock-in) par recombinaison homologue Ces modifications doivent être transmissibles par la lignée germinale d’une génération à l’autre.

Pourquoi la transgenèse? Permet d’étudier la fonction des gènes -développement embryonnaire -organogenèse -pathologies humaines

Partie 1 Souris transgénique classique ou additive: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte Principes Applications sur-expression d’un gène expression ectopique d’un gène analyse des régions régulatrices d’expression des gènes « rescues » Système inductible d’expression du transgène (tet-ON, tet-OFF) Système conditionnel d’expression du transgène (CRE-loxP) Approches siRNA (ou shRNA)

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES La transgenèse a pour but: d’introduire de manière stable (transmissible) un ou plusieurs gènes exogènes dans le génome de l’animal hôte L’introduction de l’ADN s’effectue: - par micro-injection dans l’embryon au stade 1 cellule

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES Le développement de l’embryon en phase de pré-implantation: du zygote au blastocyste DNA 1000 copies

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES Le développement de l’embryon de souris

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES Traitement hormonal des souris femelles (superovulation) Accouplement des femelles superovulées Le lendemain: prélèvement et sélection des embryons au stade 1 cellule Micro-injection de l’ADN en solution et linéaire dans le pronucléus mâle (plus gros que le pronucléus femelle) Transfert immédiat des œufs micro-injectés dans l’oviducte de femelles pseudo- gestantes. 19 à 20 jours plus tard, naissance d’une portée Génotypage des bébés afin d’identifier ceux ayant intégré le transgène dans leur génome (individus fondateurs ou F0 ou founder)

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES partie 1

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES Quel type de transgène? * Plasmide (<20 kb) promoteur cDNA IVS pA * BAC bacterial artificial chromosome 100-300 kb * YAC yeast artificial chromosome 150-2000 kb

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES Les aléas de l’insertion * Plasmide (<20 kb) promoteur cDNA IVS pA Extinction d’un gène endogène Activation ectopique du transgène Extinction de l’expression du transgène Gène endogène enhancer + CH3 -

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES CONCLUSION: Intégration aléatoire peut donc produire des phénotypes différents IMPORTANT: analyser plusieurs lignées transgéniques indépendantes pour confirmer la spécificité du phénotype obtenu

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES Surmonter les aléas de l’insertion * Plasmide (<20 kb) * BAC bacterial artificial chromosome 100-300 kb * YAC yeast artificial chromosome 150-2000 kb Permet le clonage du locus entier introns séquences de régulation E I SR

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 1-PRINCIPES Surmonter les aléas de l’insertion * BAC bacterial artificial chromosome 100-300 kb * YAC yeast artificial chromosome 150-2000 kb - Production de tous les produits du locus génomique et ce dans des proportions qui reflètent la situation endogène L’expression du transgène est dépendante du nombre de copie et indépendante de la position - Cela permet l’analyse de l’effet « gene dosage »

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION Toutes les applications de la transgenèse ont pour but de définir la fonction d’un gène

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION A- Expérience de « sauvetage » (rescue experiment) gène b wild type (WT) Zygote mutant Mutant spontané = mutation du gène b Défaut du développement = mimant un syndrome humain Souris transgénique ne présentant plus le défaut phénotypique Pour vérifier que le gène muté associé au syndrome est l’élément causal du phénotype Pour confirmer la fonction d’un gène

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION B- études de surexpression La plupart des « désordres » ou maladies sont causés par la perte de fonction d’un gène (absence ou mutation conduisant à son inactivation). Mais ils peuvent aussi être liés à une surexpression du gène Cause de la surexpression d’un gène mutations dans les régions de régulation mutations qui affectent la stabilité de l’ARNm ou de la protéine duplication de région génomique

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION B- études de surexpression Cause de la surexpression d’un gène mutations dans les séquences de régulation (SR) augmentation de l’activité transcriptionnelle SR Gène t mutations affectant la stabilité de la protéine SR Gène m aaaa Stable ARNm m Stable proteine m

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION B- études de surexpression Il est clair que les divers aspects phénotypiques de ce syndrome sont causés par la surexpression de plusieurs gènes L’analyse transgénique permet justement de disséquer la contribution de chaque gène dupliqué dans un phénotype particulier Syndrome de Down (ou trisomie 21) duplication de région génomique

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION B- études de surexpression gène Ets2 gène Ets2 Zygote WT chr Souris transgénique présentant le phénotique cardiaque associé au syndrome de Down

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION B- études de surexpression POINT IMPORTANT Tous les gènes ne sont pas sensibles au « gene dosage » c’est à dire au fait que lorsque vous augmentez la quantité, vous produisez un phénotype Tous les gènes présentent deux copies (deux allèles). D’un point de vue évolutif il est logique d’exprimer suffisamment de protéine à partir d’un seul allèle de sorte que si une mutation a lieu dans l’autre allèle, elle n’affecte pas la survie. Cependant pour certains gènes, une quantité précise de protéine doit être produite. Ces gènes sont souvent des molécules de signalisation ou impliquées dans la mise en place d’un gradient. Des changements dans le niveau d’expression vont donc perturber ce gradient et donc produire des anomalies.

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION C- études d’expression ectopique Ces études visent à exprimer un gène dans un territoire où il n’est normalement pas présent, c’est à dire modifier son patron d’expression endogène Ces études ont pour but de montrer qu’un gène est impliqué dans une voie de différentiation, par exemple.

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION C- études d’expression ectopique gène Sox9 Zygote XX Souris transgénique XX développant des gonades mâles au lieu de gonades femelles Cette étude montre que le gène Sox9 à lui seul peut induire la différentiation des gonades mâles Vidal V. et al. 2001

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION D- Analyse des éléments de régulation en cis Au cours du développement, l’expression des gènes est hautement régulée 5’ 3’ enhancer Promoteur proximal enhancer enhancer Exon Intron Gène l SR Des pathologies (ou désordres ou phénotype) peuvent être liées à des modifications de ces régions régulatrices Il est donc crucial de caractériser ces séquences régulatrices (SR)

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION D- Analyse des éléments de régulation en cis GFP LacZ Kidney enhancer Promoteur minimal Ear enhancer Promoteur minimal Zygote WT Zygote WT

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 2-APPLICATION D- Analyse des éléments de régulation en cis GFP Hoxb7 promoter Human b-globin Zygote WT Sriniva S. et al. 1999

3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes A- Tetracycline-inducible system B- Tamoxifen system C- Cre-loxP & Flp-FRT system Les systèmes inductibles sont nécessaires lorsqu’on veut activer l’expression d’un gène à un stade tardif du développement ou au stade adulte. Principalement ces systèmes font appel à l’administration d’agents chimiques.

3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes A- Tetracycline-inducible system tetracycline repressor Viral protein tetR VP16 Transcriptional Activation domain DNA-binding domain tTA = tetracycline-controled transactivator Tetracycline ou doxycycline

partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes A- Tetracycline-inducible system Tet-OFF tetracyline tTA tTA + - prom. min. prom. min. TRE TRE gene Gene OFF Recognition domain Recognition domain TRE Gene prom. min. - Recognition domain tTA Tet-ON tetracyline Gene ON + Tetracycline ou doxycycline

3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes B- Tamoxifen system Récepteur d’oestrogène Gène d’intérêt ER Proteine de fusion - Tamoxifen (ligand du récepeteur) = Protéine inactive + Tamoxifen (ligand du récepeteur) = Protéine active Feil et al. 1996

3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes C- Cre-loxP et Flp-FRT system On peut aussi induire l’expression du transgène en utilisant: une recombinase « site-specific » Ces recombinases reconnaissent une courte séquence palindromique et induisent une recombinaison homologue entre les deux sites En fonction de l’orientation de la paire de sites, la recombinaison résulte en une Inversion ou un excision Cre-loxP system Flp-FRT system loxP site FRT site ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat gaagttcctattctctagaaagaataggaacttc Spacer (8bp) Spacer (8bp)

3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes C- Cre-loxP system Excision Inversion Intervening DNA Cre recombinase loxP Intervening DNA Cre recombinase +

partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes C- Cre-loxP system Pour exprimer spécifiquement un gène dans un tissu Ubiquitous promoter LoxP LoxP Tissue-specific promoter X STOP cassette reporter recombinase Tissus exprimant la recombinase Cre Activation du reporter dans le tissu

partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes C- Cre-loxP system Pour étudier le lignage cellulaire Ubiquitous promoter LoxP LoxP Tissue-specific promoter X STOP cassette reporter recombinase Tissus exprimant la recombinase Cre Activation du reporter dans le tissu Cette approche peut être utilisée pour analyser le devenir d’un type cellulaire OU retrouver l’origine d’un type cellulaire differentiation Activation du reporter dans les cellules dérivant de ce tissu

Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 3-les systèmes inductibles: comment contrôler l’activation des gènes Les banques de données des outils CRE CREATE http://dev.creline.org/home CRE-X-Mice http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php Jackson laboratory http://cre.jax.org/index.html

4- l’utilisation de siRNA (dsRNA) partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 4- l’utilisation de siRNA (dsRNA) Par la technique de transgenèse, on peut aussi induire l’expression de siRNA chez la souris. Le siRNA est une molécule d’ARN qui dégrade l’ARNm Donc, introduire un siRNA dans la souris revient à invalider un gène Cependant, avec les siRNA, la dégradation des ARNm n’est pas de 100% on ne parle pas de knock-out de gène mais de knock-down (70 à 80% du gène est inactivé)

4- l’utilisation de siRNA partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 4- l’utilisation de siRNA siRNA = Short interference RNA Hitz et al. 2009

4- l’utilisation de siRNA partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 4- l’utilisation de siRNA Hitz et al. 2009

4- l’utilisation de siRNA partie 1 Souris transgénique classique: intégration aléatoire du transgène dans le génome hôte 4- l’utilisation de siRNA Zygote WT Knock-down = 70-80 % de réduction de l’expression du gène Utile pour étudier des phénotypes intermédiaires comme ceux dus à mutations hypomorphes

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée Partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée Partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte Principes Génération de souris « knock-out »: invalidation d’un gène Invalidation conditionnelle d’un gène: « knock-out » conditionnel Génération de souris « knock-in »: remplacement d’un gène par un autre Utilisation du locus ROSA26: surexpression d’un gène ou expression d’un siRNA (ou shRNA)

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 1- PRINCIPES La mutagénèse dirigée dans le génome de la souris est basée sur la recombinaison homologue entre une construction ciblante introduite dans des cellules souches (ES) et la séquence endogène correspondante Les cellules ES génétiquement modifiées sont introduites: - dans l’embryon de souris au stade blastocyste

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 1- PRINCIPES L’injection Cellules ES dans lesquelles a eu lieu la recombinaison homologue blastocyste

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 1- PRINCIPES ICM= inner cell mass = masse cellulaire interne blastocyste Les cellules souches embryonnaires (ES) sont des cellules en culture isolées à partir de la masse cellulaire interne de l’embryon au stade blastocyste. Ces cellules gardent leur totipotence lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions adéquates: c’est à dire qu’elles peuvent participer au développement de tous les types cellulaires de l’embryon (y compris les cellules germinales) lorsqu’elles sont réintroduites dans un embryon au même stade. Les celulles ES ayant subi la recombinaison homologue sont ensuite injectées dans un blastocyste qui sera réimplanté dans une femelle pseudogestante. Le développement de ce blastocyste donnera naissance à une souris chimère dont une partie des cellules germinales (ou toutes les celulles germinales) dériveront des cellules ES modifiées. Le transgène pourra donc être transmis et une lignée de souris mutante établie.

partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 1- PRINCIPES Cellules ES dans lesquelles a eu lieu la recombinaison homologue Souris noire Souris sauvage ou WT (wild type) Souris blanche X Souris chimère F1: hétérozygote Croisement consanguin F2: 25% d’homozygotes

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 1- PRINCIPES Souris chimères nées au laboratoire début septembre Souris agouti Souris noire

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 1- PRINCIPES La vecteur ciblant = targeting construct Linearization site 5’ PGK-neo-pA DT-A Positive selection cassette Negative selection cassette 5’ homology arm 3’ homology arm 3’ ADN génomique homologue: Homology arms: séquences homologues au gène que l’on veut cibler. Doit être isogénique avec les cellules ES. Cassette de sélection positive (placée à l’intérieur de la région d’homologie) PGK: promoteur actif dans les cellules ES. Neo: Néomycine (sélection avec G418). Cassette de sélection négative (placée à l’extérieur de la région d’homologie) HSV-tk: HSV-thymidine kinase (sélection avec ganciclovir ou FIAU) DT-A: diphtheria toxin A-chain (pas d’utilisation de drogue, la toxine va éliminer les cellules qui l’auront incorporée)

2- Génération de souris « knock-out »: invalidation d’un gène partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 2- Génération de souris « knock-out »: invalidation d’un gène La construction ciblante possède un marqueur de sélection (néomycine) flanqué des séquences homologues au gène cible (gène A). De plus il contient un marqueur de contre-sélection (thymidine kinase) en 3’. Cette construction est électroporée dans les cellules ES. La recombinaison a lieu entre les séquences homologues conduisant au remplacement du gène endogène par son allèle knock-out. PGK-neo-pA tk Targeting construct ATG Exon 1 Exon 2 Exon 3 Wildtype locus Gène A PGK-neo-pA Targeted locus ATG Le gène peut être remplacé par le gène rapporteur LacZ. Cela permet d’analyser avec précision l’expression du gène endogène.

prix Nobel de médecine 2007: Cette technique d’invalidation d’un gène par recombinaison homologue a été une avancée spectaculaire pour l’analyse de la fonction des gènes prix Nobel de médecine 2007: Mario Capecchi, Martin Evans, Oliver Smithies

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 3- Génération de souris « knock-in »: substitution d’un gène par un autre PGK-neo-pA Gène B tk Targeting construct ATG Exon 1 Exon 2 Exon 3 Wildtype locus Gène A PGK-neo-pA Gène B Targeted locus ATG La construction ciblante possède le gène à insérer (gène B), le marqueur de sélection (néomycine) et de contre- sélection (thymidine kinase) ET l’homologie avec le locus du gène endogène que l’on veut substituer (gène A). Cette construction est électroporée dans les cellules ES. La recombinaison a lieu entre les séquences homologues conduisant au remplacement du gène endogène A par le gène B.

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 3- Génération de souris « knock-in »: substitution d’un gène par un autre Application de la technique: étudier la redondance fonctionnelle des gènes Gene A Gene B Genes homologues (appartiennent à la même famille) Remplacement du gène A par B Phénotype normal = gène B fonctionnellement équivalent au gène A

4- « knock-out »conditionnel partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 4- « knock-out »conditionnel Dans le knock-out traditionnel, le gène est invalidé dés les premières étapes du développement (puisque la modification génétique est introduite au stade blastocyste). Si ce gène est crucial pour les premières étapes du développement, l’embryon ne va pas se développer et l’analyse de la fonction de ce gène ne pourra pas se faire. Il est donc important de pouvoir contrôler dans le temps ET l’espace, l’invalidation de ce gène. Pour ce faire on utilise le système Cre-loxP vu précédemment.

4- « knock-out »conditionnel: Cre-loxP system partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 4- « knock-out »conditionnel: Cre-loxP system LoxP LoxP Tissue-specific promoter X E1 E2 E3 recombinase Tissus n’exprimant pas la recombinase Tissus exprimant la recombinase Cre LoxP LoxP E1 E3 Invalidation du gène E1 E2 E3 La construction ciblante possède deux sites loxP entre l’un des exons du gène à cibler. Cette construction est electroporée dans les cellules ES. Les cellules ES ayant subi la recombinaison homologue sont injectées au stade blastocyste. Ces souris sont croisées avec des transgéniques possèdant une Cre sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’un tissu. Dans les cellules doublement transgéniques, dans les cellules exprimant la Cre la région génomique flanquée des sites LoxP sera excisée, générant un allèle null.

partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 4- « knock-out »conditionnel: Cre-loxP system dependant du tamoxifen LoxP LoxP récepteur d’oestrogène Tissue-specific promoter X ER E1 E2 E3 Cre LoxP E1 E2 E3 Tissus exprimant la Cre-ER mais n’ayant pas reçu de Tamoxifène E1 E3 Invalidation du gène Tissus exprimant la Cre-ER ET ayant reçu le Tamoxifène Ce système est utilé si l’on veut inactiver une gène au stade adulte (par exemple)

5- l’utilisation du locus ROSA26 partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 5- l’utilisation du locus ROSA26 La recombinaison homologue peut aussi être utilisée pour ajouter un gène, un siRNA, etc… dans le génome Locus ROSA26 facile à cibler s’exprime dans la plus part des cellules

5- l’utilisation du locus ROSA26 partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 5- l’utilisation du locus ROSA26 shRNA Knock-in gene Gain-of-function Hitz et al. 2009

5- l’utilisation du locus ROSA26 partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 5- l’utilisation du locus ROSA26 Targeting vector loxP loxP attP attP 5’ 3’ SA Pgkneo5xpA shRNA X Rosa26 Pgkneo5xpA SA R26floxneoshRNA shRNA loxP attP SA R26shRNA Cre loxP shRNA attP

Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte Au niveau international: plusieurs programmes ont été initiés dans le but de générer des invalidations pour TOUS les gènes de la souris EUCOMM NorCOMM KOMP IKMC International Mouse consortium www.knockoumouse.org EUCOMM: european Conditional Mouse Mutagenesis Program KOMP: Knockout Mouse Project (NIH) NorCOMM (North American Conditional Mouse Mutagenesis project)

Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation Partie 3 Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation

Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation Partie 3 Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation 2 manières d’obtenir des chimères injection agrégation Application de cette méthode contourner un problème de létalité précoce de l’embryon (en particulier dû à un défaut de formation des structures extra-embryonnaires)

Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation Partie 3 Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation Rossant J et al. 2009

Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation Partie 3 Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation Génération d’embryons tétraploïdes par électrofusion (embryon au stade deux cellules) electrofusion 4n 2n Embryon tétraploïde Eakin GS et al. 2006 Nature Protocol Agrégation entre 2 embryons tétraploïdes et cellules souches (mutantes) Les cellules mutantes contribuent à tous les dérivées de la ICM mais pas aux lignages extraembryonnaires (trophectoderme + endoderme primitif)

Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation Partie 3 Souris transgéniques générées par chimère d’agrégation 2n 4n 2n 4n Les cellules tétraploïdes vont contribuer à certains Types cellulaires (trophectoderm + endoderme primitif) Les cellules tétraploïdes présente un défaut de compétence Dans le contexte de l’analyse d’un mutant (targeted ES cells), ce type de stratégie peut être utilisée pour contourner une mort précoce causée par un défaut du trophectoderme ou de l’endoderme primitif

biomédicale comme modèle pour la biologie humaine. La souris de laboratoire = l’espèce de mammifère principalement utilisée en recherche biomédicale comme modèle pour la biologie humaine. La souris mutante est la ressource centrale pour comprendre le contrôle de l’expression des gènes et la fonction des gènes. RDV: 2 novembre. Modèles animaux de pathologies humaines

5- introduction de mutation Chap 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 5- introduction de mutation Les pathologies peuvent être le résultat de mutations plutôt que d’invalidation totale d’un gène: Mutations peuvent conduire à l’absence de la proteine (frame-shift, introduction d’un codon stop) peuvent conduire à une protéine avec une activité réduite. Ces mutations sont intéressantes si l’on veut étudier un phénotype hypomorphe (lorsque la protéine que l’on veut étudier n’est pas complètement invalidée) ou si l’on veut étudier certains aspects de la fonction d’une protéine. peuvent conduire à une protéine avec une activité constitutive La recombinaison homologue peut donc être utilisée pour introduire une mutation choisie dans un gène.

5- introduction de mutation: stratégie Hit and run Chap 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 5- introduction de mutation: stratégie Hit and run La construction ciblante contient une mutation ponctuelle dans l’exon 2, un marqueur de selection (neo), un marqueur de contre-selection (tk). Après recombinaison homologue dans les cellules ES, le locus ciblé possède une duplication partielle de la séquence génomique. Ces cellules ES sont cultivées. Des recombinaisons intra- chromosomales ont lieu et les cellules ES qui vont survivre seront celles qui auront accomplies la recombinaison Intrachromosomale et donc perdues la cassette HSV-tk. Avantage de cette technique: aucune séquence exogène n’est maintenue dans le locus

5- introduction de mutation: stratégie double remplacement Chap 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 5- introduction de mutation: stratégie double remplacement Deux étapes: la région contenant l’exon que l’on souhaite muté est remplacée par une cassette sélection/contre sélection (neo/HSV-tk). Les cellules électroporées sont sélectionnées pour leur résistance à G-418. Puis ces cellules sont électroporées avec une construction ciblante qui enjambe la région délétée afin d’y introduire la mutation ponctuelle. La perte de la cassette de contre-selection (HSV-tk) est utilisée pour la sélection (les cellules ES correctement ciblées vont survivre dans un milieu avec Ganciclovir ou FIAU parce qu’elles ont perdues la cassette HSV-tk). Avantage de cette technique: aucune séquence exogène n’est maintenue dans le locus

5- introduction de mutation: Cre/loxP gene targeting Chap 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 5- introduction de mutation: Cre/loxP gene targeting neo tk neo La construction ciblante possède une séquence homologue au locus endogène mais portant déjà la mutation ponctuelle. De plus, une cassette de selection flanquée des sites loxP est insérée à côté de la mutation. La recombinaison homologue dans les cellules ES remplace le locus endogène par la construction ciblante. Finalement la cassette de selection est excisée par l’expression transitoire d’une Cre dans les cellules ES. Inconvenient de cette technique: une séquence exogène est maintenue dans le locus: séquence loxP

partie 2 Souris transgéniques par recombinaison homologue: intégration ciblée du transgène dans le génome hôte 4- « knock-out »conditionnel: Cre-loxP system dependant du tamoxifen LoxP LoxP récepteur d’oestrogène Tissue-specific promoter X ER E1 E2 E3 Cre LoxP E1 E2 E3 Tissus exprimant la Cre-ER mais n’ayant pas reçu de Tamoxifène E1 E3 Invalidation du gène Tissus exprimant la Cre-ER ET ayant reçu le Tamoxifène Ce système est utile si l’on veut inactiver une gène au stade adulte