Exploration des réponses immunitaires ED L3 Février 2018

Réponse immunitaire Microbes Bactéries, virus parasites, champignons Immunité Innée Immunité adaptative Complément CD4 CD8 Cellulaire Lymphocytes T Macrophage Tissus Lymphocyte B Polynucléaire N Cellule Dendritique Humorale Monocyte Plasmocyte NK Phagocytose Migration Périphérie Organes lymphoïdes Ganglion Agression Plaie, effraction Inflammation

Immunité Innée/adaptative

Hémogramme Leucocytes Polynucléaires neutrophiles Polynucléaires éosinophiles Polynucléaires basophiles Lymphocytes Monocytes Leucocytes Polynucléaires neutrophiles Polynucléaires éosinophiles Polynucléaires basophiles Lymphocytes Monocytes 4 000 - 10 000/mm3 1 700 - 7 000 50 - 500 0 – 50 1 500 - 4 000 100 - 1000 4 000 - 10 000/mm3 1 700 - 7 000 50 - 500 0 – 50 1 500 - 4 000 100 - 1000 Immunité innée adaptative

Immunité innée Barrière cutanéo-muqueuse Substance bactéricide, pH Phagocytes: PNN, monocyte Cellules NK Cellules dendritiques Système du complément Cytokines (interféron)  NFS Immunophénotypage  Exploration du complément

Immunité Innée: exploration du complément Voie classique Voie alterne Voie des lectines Mesure fonctionnelle: CH50 Mesure protéine du complément: - C3 - C4 Complexe d’attaque membranaire

Immunité Innée: exploration du complément Mesure fonctionnelle: CH50 GR de mouton + Ac anti GR de mouton + Sérum du sujet GR de lapin + Sérum du sujet Voie classique Voie Alterne Activation du complexe terminal DO 50% Lyse du GR Mesure de l’Hb libérée Augmentation: processus inflammatoire Diminution: consommation, déficit

< Cellule NK + CD2 CD16 CD56 CMH I Cellule Tumorale CMH I Ou infectée CD56 CMH I CMH I Récepteurs Inhibiteurs < Cellule NK CMH II Récepteurs activateurs + CD25 Cellule modifiée tuée NK activée Exploration numérique (cytométrie en flux à l’aide d’Ac spécifique des molécules distribuées sélectivement sur les NK). Exploration fonctionnelle (cytolyse).

Immunité innée: cellules NK Etude en cytométrie en flux: CD3- CD56+ (quantitative)

Immunité innée: cellules NK Etude fonctionnelle Mesure de la cytotoxicité par relargage de Cr radioactif Marquer les cellules cibles avec du Na251CrO4 Ajouter les cellules NK (ou T cytotoxiques) aux cellules cibles marquées Les cellules tuées libèrent Du chrome radioactif Radioactivité libérée proportionnelle au nombre de cellules détruites

Ontogenèse lymphocytes T et B Immunité adaptative Ontogenèse lymphocytes T et B

Immunité adaptative NFS Cytométrie en flux Lymphocyte B Phénotypage lymphocytaire T et B Marqueurs d’activation lymphocytaire Marqueurs cellules naïves/cellules mémoires Tests fonctionnels Prolifération Production de cytokines Test de cytotoxicité Production d’anticorps Lymphocyte B  production Ac Lymphocyte T  prolifération  cytotoxicité

Immunité adaptative: cytométrie en flux

Immunité adaptative: cytométrie en flux Lymphocytes T: CD3+: 50 - 80% 900 – 3000/mm3 Ly T4: CD3+ CD4+: 32 - 52% 450 – 1500/mm3 Ly T8: CD3+ CD8+: 20 – 40% 300 – 1000/mm3 Lymphocytes B: CD19+: 5 – 20% 100 – 450/mm3

Isolement des lymphocytes - gradient de densité récupération d’un anneau cellulaire contenant lymphocytes et monocytes Cellules mononuclées GR, PNN Centrifugation sur un milieu de séparation de densité Ficoll-Hypaque

Exploration immunité humorale Cytométrie en flux: nombre de LB marqueur de différenciation LB naïfs: CD27-/ IgM+/ IgD+ LB mémoire avant commutation: CD27+/IgM+/IgD+ LB mémoire après commutation: CD27+/IgM-/IgD- Prolifération Etude production d’anticorps EPP Dosage des Ig Réponse vaccinale In vitro In vivo

Exploration immunité humorale in vitro Dosage des gammaglobulines Dosage des classes d’Ig: - IgG 6.6-12.8 - IgA 0.7-3.4 - IgM 0.5-2.1 Dosage des sous-classes d’Ig: - IgG1 3-12.8 - IgG2 0.4-6.3 - IgG3 0.12-1.14 - IgG4

Exploration immunité humorale in vivo Réponse vaccinale: Sérologies pré et post vaccinales Diphtérie Tétanos Pneumocoque Haemophilus

Immunité adaptative: cellulaire Cytométrie en flux: phénotypage lymphocytaire T: CD3, CD4, CD8 marqueurs d’activation lymphocytaire: HLA-DR marqueur de différenciation LT naïfs: CD45RA+/CD62L+ LT central mémoire: CD45RA- ou RO+/CD62L+ LT effecteur mémoire: CD45RA- ou RO+/CD62L- LT revertant: CD45RA+ ou RO-/CD62L- Prolifération Production de cytokine Elisa Elispot Test de cytotoxicité Test d’hypersensibilité retardée In vitro In vivo

Exploration immunité cellulaire: prolifération Activateurs non spécifiques: mitogènes polyclonaux phytohémagglutinine ou PHA: lymphocytes T Concanavaline ou ConA: lymphocytes T pokeweed mitogen ou PWM: lymphocytes T (et B) Induisent la mitose de beaucoup de Ly de spécificité différente = prolifération polyclonale Activateurs spécifiques Antigène de vaccination: tuberculine, anatoxine tétanique Antigène de l’environnement: streptocoque, CMV

Exploration immunité cellulaire: prolifération Mesure de la prolifération par incorporation de thymidine tritiée 3TH (radioactive) Expression en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif) par rapport à sujets sains témoins

Exploration immunité cellulaire: prolifération Mesure de la prolifération en cytométrie en flux après marquage au CFSE CFSE: marqueur fluorescent, rentre dans le cytoplasme A chaque division cellulaire, la fluorescence diminue de moitié dans chaque cellule fille

Cytokines: orientation de la réponse immunitaire cellulaire Immunité Innée Orientation de la réponse immunitaire

Polarisation de la réponse T Cytokines: orientation de la réponse immunitaire cellulaire Polarisation de la réponse T Cellulaire (pathogènes à x Intracellulaire T-bet STAT-4 IFNg IL12 TH1 Humorale (pathogènes à x Extracellulaire IL4 GATA-3 STAT-6 IL4 TH2 Neutrophile (pathogènes à x Extracellulaire RORgT STAT-3 IL17 T CD4 Naïf TGFb1 IL6 TH17 TGFb1 Régulation Négative FoxP3 TGFb1 Thymocyte Treg

Exploration immunité cellulaire Mesure production de cytokines par cellules immunitaires Activation des cellules en culture non spécifique / spécifique Récolte du surnageant de culture après 24 à 48 h Quantification des cellules CD4+/CD8+ productrices Dosage Immunoenzymatique Dosage Cytométrie en flux Cytométrie en flux ELISPOT

Production de cytokines Exploration immunité cellulaire Production de cytokines Activation de cellules en culture (non spécifique ou spécifique) Récolte du surnageant de culture après 24-48h Dosage ELISA ou en CMF

Production de cytokine: ELISPOT Exploration immunité cellulaire Production de cytokine: ELISPOT Quantification des cellules T productrices d’IFN après stimulation - par des peptides de 9 aa  réponse des LT CD8+ spécifiques - par des Ag ou des peptides de 20 aa  réponse des LT CD4+ spécifiques Y IFN Peptides ou antigène PAL substrat jaune violet capturer les molécules sécrétées par des cellules sur un support solide sensibilisé. Après élimination des cellules, l'immunocomplexe est révélé par une méthode ELISA utilisant un substrat chromogène insoluble, dont la précipitation localisée génère des taches colorées ou immunospots

Exemple du Quantiféron

Hypersensibilité retardée Exploration immunité cellulaire Hypersensibilité retardée Exemple du test à la tuberculine Injection intra-dermique de tuberculine (extrait de Mycobactérium tuberculosis) Immunité à médiation cellulaire Réponse locale (papule rouge indurée) à lire 72h après: <5mm: réaction négative: pas de contact antérieur avec BK ou BCG déficit immunitaire si contact antérieur >5mm: réaction positive: contact antérieur phlycténulaire ou nécrotique: suspicion d’infection Histologie: lymphocytes T et nombreux monocytes/macrophages

Hypersensibilité retardée Immunité adaptative: cellulaire Hypersensibilité retardée Exemple du test à la tuberculine  Traduction histologique: granulome présence de lymphocytes T et de nombreux monocytes/macrophages