BENLARIBI IMANE HALIMA Pharmacienne praticienne spécialiste Assistante en Parasitologie _ Mycologie médicale REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE LA SANTE, DE LA POPULATION ET DE LA REFORME HOSPITALIERE INSTITUT NATIONAL DE FORMATION SUPERIEURE PARAMEDICALE CONSTANTINE Filière: Larorantin de santé public Année: 2018/2019

I.Définition /Indications/Limites II.Préparation du malade III.Prélèvement/ Technique de conservation IV.Fiche de renseignement V.Examen parasitologique des selles VI.Examen après concentration VII.Techniques de coloration VIII.Coproculture en parasitologie

La coprologie parasitaire = l’examen parasitologique des selles (EPS) M.E.E et identification Des parasites et champignons vivant dans le T.D Selles :moyen d’élimination dans le milieu extérieur

Cas d’oxyures Cas de Tænia saginata Scotch test anal Phase coprologiquement muette Giardiose,Amibiase Répéter l’examen 3 fois/ 3-4j d’intervalle Phase de migration larvaire Diagnostic Sérologique

Enterobius vermicularis

Ascaris lumbricoides

Eviction de médicaments opaques non absorbables; – Charbon végétal – Produits de contraste – Substances grasses: huile laxatif, suppositoires ↗volume de culot (centrifugation)/ pellicule de flottation

Eviction d’aliments laissant beaucoup de résidus; – Légumes secs, – Légumes verts, – Fruits à cuticules résistantes – Grains à enveloppes sclérifiées, – Fruits à grains nombreuses et de petite taille

Eviction d’aliments et médicaments colorants les selles; – Betterave – Charbon – Fumafer

Avant toute thérapeutique Antiparasitaire. – Ex: métronidazole, fluvermal …etc.

Selles fraiches du matin; Dans une boite propre, sec, large couvercle, fermée hermétiquement, étiquetée; 30 – 50 g de selles non mélangées aux urines.

L’idéal au laboratoire; Rapidement acheminée au laboratoire (-1h)

Ankylostoma duodenale Necator americanus

L’idéal au laboratoire; Rapidement acheminée au laboratoire (-1h) Sinon la conservée dans un fixateur;

Conservation des vers 1 ère étape: Lavage à l’eau physiologique 2 ème étape: Fixation: 3 ème étape: Conservation: alcool à 70°. Nématodes Alcool à 70° bouillant Nématodes Alcool à 70° bouillant Trématodes Alcool à 70° bouillant, 1V Alcool à 70° bouillant +1V formol 10% Trématodes Alcool à 70° bouillant, 1V Alcool à 70° bouillant +1V formol 10% Cestodes Alcool à 70° bouillant, 90ml Alcool à 90° bouillant + 10ml formol Cestodes Alcool à 70° bouillant, 90ml Alcool à 90° bouillant + 10ml formol

Nom prénom âge du patient L’adresse(zone urbaine, rurale, d’endémie) La notion de séjour en zone d’endémie Les habitudes culinaires Le tableau clinique et les signes para clinique Notion d’un terrain d’immunodépression Notion de traitement en cours notamment antiparasitaire

Comporte obligatoirement: L’examen direct entre lame et lamelle d’un étalement mince de la selle fraîche ; L’examen après une concentration par deux méthodes de routine.

Examen direct Comporte : Un examen macroscopique e Et Un examen microscopique

Examen macroscopique Consistance

Consistance: Teneur en eau + la vitesse de transit. Les selles : moulées, molles, très molles ou liquides. +Mucus ou sang,. Indicateur: la présence de formes végétatives ou de kystes de protozoaires.

Consistance: Plusieurs prélèvement: – Selles contiennent du sang et du mucus, – Selles liquides. – Selles moulées.

Examen macroscopique Consistance Couleur

Examen macroscopique Consistance Couleur parasitaires Eléments surajoutés Présence de sang, mucus… -anneaux de Tænia -adules d’Ascaris -adules d’Oxyure

Aspect d’une selle normale: Poids: 110 – 150 g ; Couleur: brune ; Consistance: ferme moulée ; ph ≈ 7 ; Examen microscopique: – Fibres musculaires bien digérées =corps de Nothnagel ; – Cellulose non digestible =poils et vaisseaux spiralés ; – Amidon: régime est riche en féculents.

Etat frais (G Χ10,GΧ40) selle Verre à pied NaCL 9‰ Microscope optique Lame + lamelle Examen microscopique Lugol double à 1%

Examen microscopique NB: Pour les selles glaireuses, on prélève directement la glaire qu’on examine entre lame et lamelle.

Examen microscopique La préparation dans l’eau physiologique Mobilité de trophozoites de protozoaires et larves d'helminthes kystes de protozoaires Œufs d’helminthes.

Kystes d’Entamoeba coli et d’Endolimax nanus

Kystes de Pseudolimax butschlii

Kystes de Chilomastix mesnili

Œuf de Taenia

Œuf d’ Hymenolepis nana

Œuf de Fasciola hepatica

Œufs de Dicrocoelium dendriticum

Œuf de Schistosoma mansoni

Œuf de Schistosoma intercalatum

Œufs d’Ascaris lumbricoides

Œuf de Trichirus trichiura

Examen microscopique La préparation àl’iode les kystes d'amibes et de flagellés. Vacuole iodophile de Pseudolimax butshlii. Les noyaux des kystes (chromatine) en brun foncé.

Kyste d’Entamoeba coli

Kyste de Enndolimax nanus

Kyste de Giardia intestinalis

Kyste de Chilomastix mesnili

But: Réunir dans un faible volume les éléments parasitaires initialement dispersées dans une grande masse de fèces Sans intérêt pour les formes végétatives qu’elles altèrent.

Classification Techniques de concentration Méthodes physiques Méthodes physico- chimiques Méthodes par éclaircissement Méthodes spéciales

Classification Techniques de concentration Méthodes physiques Méthodes physico- chimiques Méthodes par éclaircissement Méthodes spéciales

Méthodes physiques: Principe: différence de densité entre réactif diluant/parasite

Méthodes physiques: Technique de sédimentation Technique de flottaison Densité RF<P Densité RF>P &

Méthodes physiques: Technique de sédimentation Technique de flottaison Densité RF<P Densité RF>P

L’eau glycérinée 0,5% L’eau glycérinée 0,5% Sédimentation 1h Répéter nX Surnageant limpide Répéter nX Surnageant limpide Culot

Œufs de Schistosoma mansoni

Œufs d’Ascaris lumbricoides non fecondés

Larve rhabditoide de Strongyloides stercoralis (Anguillule)

Techniques de sédimentation Simples + longues, à nombreuses manipulation Non indiquées en routine

Méthodes physiques: Technique de sédimentation Technique de flottaison Densité RF<P Densité RF>P

Na Cl 25% Na Cl 25% Tamisage mn

Œufs des Ankylostomes Œufs d’Ankylostoma duodenale Œufs ds Necator americanus

Œufs d’ Hymenolepis nana

Classification Techniques de concentration Méthodes physiques Méthodes physico- chimiques Méthodes par éclaircissement Méthodes spéciales

Méthodes physico-chimiques ou diphasiques: Sédimentation Coefficient de partage entre 2 phases LipophileHydrophile

Diluant Homogénéiser Tamiser Homogénéiser Tamiser Ether sulfurique Centrifugation 1500t/mn pd3mn Centrifugation 1500t/mn pd3mn

Couche d’éther chargée de graisse. Couche épaisse de débris lipophile. Couche aqueuse. Culot à examiner.

Diluant Homogénéiser Tamiser Homogénéiser Tamiser Ether sulfurique Centrifugation 1500t/mn pd3mn Centrifugation 1500t/mn pd3mn

Techniques diphasiques TechniqueDiluantIndication BAILENGERTampon acéto-acétique pH5Kystes de protozoaires RITCHIE SIMPLIFIÉEFormol à 10%Œufs d’helminthes et kystes de protozoaire

Classification Techniques de concentration Méthodes physiques Méthodes physico- chimiques Méthodes par éclaircissement Méthodes spéciales

Méthode par éclaircissement Technique qualitative de KATO-KATZ Technique quantitative de KATO- MIURA Les œufs d’ helminthes particulièrement des Schistosomes et larves d’ Anguillule

Tremper des rectangles de 2x5cm de cellophane pd 24h ds la solution A (glycérine+ED+ vert malachite à 3%) Déposer le rectangle sur un étalement de selles déjà tamisé Retourner puis écraser la préparation sur un papier filtre Lecture: 30-60mn après à l’ objectifx10

Classification Techniques de concentration Méthodes physiques Méthodes physico- chimiques Méthodes par éclaircissement Méthodes spéciales

Méthode à la cellophane adhésive ou scotch test de GRAHAM Méthodes d’extraction des larves d’Anguillule

Méthodes spéciales Méthode à la cellophane adhésive ou scotch test de GRAHAM Méthodes d’extraction des larves d’Anguillule

Méthodes spéciales Méthode à la cellophane adhésive ou scotch test de GRAHAM Méthodes d’extraction des larves d’Anguillule

2-3h 10ml Centrifugation1500t/mn pd3-5mn

Indication Identification/dgc différentiel: espèces d’amibes (FV++) Conservation du matériel didactique Envoi vers un autre labo (avis) Indispensable : dgc cryptosporidies et microsporidies.

Classification Techniques de coloration Colorations instantanées entre lame et lamelle Colorations de frottis secs ou humides Colorations spécifiques

Classification Techniques de coloration Colorations instantanées Colorations de frottis secs ou humides Colorations spécifiques

Colorations instantanées Méthode de Bailenger Méthode de Sapero Lawless et Strome (MIF)

Colorations instantanées Méthode de Bailenger Méthode de Sapero Lawless et Strome

Eau phy 0,9% Homogénéiser COLORANT DE BAILENGER

Colorations instantanées Méthode de Bailenger Méthode de Sapero Lawless et Strome Sur lame Sur tube

Eau phy 0,9% Homogénéiser Colorant MIF Immédiat ou après 20-30mn Immédiat ou après 20-30mn Méthode de Sapero Lawless et Strome –sur lame-

Indication: Selles glaireuses. Préparation ne se conserve que pendant qq heures.

Colorations instantanées Méthode de Bailenger Méthode de Sapero Lawless et Strome Sur lame Sur tube

0,25g de selles 0,15 ml de Solution de lugol à 5% 2,35 ml de Solution mère de merthiolate Mélanger Immédiat/20-30mn Mélanger Immédiat/20-30mn

Méthode de Sapero Lawless et Strome –en tube- Résultats: Idem à la coloration sur lame. Conservation des protozoaires colorés est définitive (bien boucher le tube)

Méthode de Sapero Lawless et Strome –en tube- Indication: Qq soit la consistance des selles Fixation+ conservation +coloration.

Classification Techniques de coloration Colorations instantanées entre lame et lamelle Colorations de frottis secs ou humides Colorations spécifiques

Colorations de frottis humides Technique de KOHN au noir chlorazol Technique de Heidenhain à l’hématoxyline ferrique. Technique au Trichrome de Wheatley.

Colorations de frottis secs Technique de Brooke et Goldman

Confection du frottis:

Selle liquidienne→ frottis sanguin

Colorations de frottis humides Technique de KOHN au noir chlorazol Technique de Heidenhain à l’hématoxyline ferrique. Technique au Trichrome de Wheatley.

Technique de KOHN au noir chlorazol Noir chlorazol 8-10h Alcool 60° Lavage à l’eau de robinet Alcool 70° Alcool 80° Alcool 95° Xylène X100 à l’immersion

Colorations de frottis secs ou humides Technique de KOHN au noir chlorazol Technique de Heidenhain à l’hématoxyline ferrique. Technique au Trichrome de Wheatley.

Colorations de frottis secs ou humides Technique de KOHN au noir chlorazol Technique de Heidenhain à l’hématoxyline ferrique. Technique au Trichrome de Wheatley.

Technique de Heidenhain à l’hématoxyline ferrique En 3tps: 1 er tps: Fixation (Schaudinn acétique) 2 ème tps: Coloration (l’hématoxyline ferrique) 3 ème tps: Différentiation (l’alun de fer)

Technique de Heidenhain à l’hématoxyline ferrique Donne de bons résultats + Conservation indéfinie. mais Longue et délicate: pas pour routine.

Coproculture en protozoologie Nécessite: – Milieux spéciaux; – Suivi sur plusieurs jours; – Compétence parfaite du technicien; Permet: – Multiplication des protozoaires→ ↗% (+) – Ts protozoaires: mêmes milieux sauf: Giardia intestinalis. Trophozoïtes+++ vivaces/ kystes (48h à T° labo)

Coproculture en protozoologie Indication: Recherche : Grand nombre d’amibes Étude morphologique Biochimique Production d’Ag. Recherche : Grand nombre d’amibes Étude morphologique Biochimique Production d’Ag. Diagnostic: Forte suspicion d’amibiase EPS successifs (_). Diagnostic: Forte suspicion d’amibiase EPS successifs (_).

Coproculture en protozoologie Type de culture: Cultures polyxéniques: Flore microbienne indéfinie Cultures polyxéniques: Flore microbienne indéfinie Cultures axéniques: Bactériologiquement pure. Cultures axéniques: Bactériologiquement pure. Cultures monoxéniques: Une seule espèce bien définie de microorganisme Cultures monoxéniques: Une seule espèce bien définie de microorganisme

Coproculture en protozoologie Composition des milieux de culture: Support coagulé: Sérum de cheval ou Œuf total…+ Gélose Support coagulé: Sérum de cheval ou Œuf total…+ Gélose Élément figuré: Amidon de riz, Hématies, Sg total… Élément figuré: Amidon de riz, Hématies, Sg total… Solution saline: Ringer, Eau phy, Bouillon, Eau peptonée… +: Sérum de cheval ou Albumine d’œuf… Solution saline: Ringer, Eau phy, Bouillon, Eau peptonée… +: Sérum de cheval ou Albumine d’œuf… pH 7,2 et 7,6.

Phase liquide Élément figuré Phase solide

Phase liquide: 6V solution de Ringer+ 1V sérum du cheval Phase liquide: 6V solution de Ringer+ 1V sérum du cheval Élément figuré: amidon de riz Élément figuré: amidon de riz Phase solide: Sérum de cheval coagulé en plan incliné Phase solide: Sérum de cheval coagulé en plan incliné Milieu diphasique de DOBELL et LAIDLAW:

Coproculture en protozoologie Milieu diphasique de DOBELL et LAIDLAW : 2 tubes réchauffés à 37°C Selles fermes ou pâteuses: Anse de platine stérile Selles liquides ou mucosités: Pipette Pasteur stérile/1ml Fond du tube L’étuve à 37°C

Coproculture en protozoologie Milieu diphasique de DOBELL et LAIDLAW : 1 er contrôle: après 24h Si (-): après 48h Repiquage 24h ou 48h après liquide au contact d’amidon et du plan coagulé/pipette Amibes très mobiles/même aspect que ds les selles

Coproculture en protozoologie Milieu LMS: liquide, polyxénique Milieu Diamond: milieu axénique – Milieu Diamond: protozoaires intestinaux – Milieu HSP3M2: flagellés(Giardia intestinalis), Diamond modifié – Milieu TYI-S-33: Diamond modifié

Coproculture en helminthologie: Principe: Larves émises /selles → -- conditions--→ Stade d’adultes libres → Larves nombreuses de 2 ème génération /milieu de culture.

Coproculture en helminthologie: Indication: Dgc + de l’anguillulose Dgc différentiel entre larves d’Anguillule et: – Ankylostomes – Larves de nématodes libres

Coproculture en helminthologie: Types de culture: Charbon Papier buvard

Ttes les méthodes doivent être faites avec précautions vu le risque de contamination par les larves strongyloïdes infestantes (voie transcutanée)

Méthode de HO-THI-SANG:

Méthode de Harada et Mori:

Pour toutes les deux méthodes: Incubation: à 25°C Lecture: 48h après, jusqu’à 15j par examen quotidien

Méthode de Ho-Thi-SangMéthode de Harada et Mori Recherche s/loupe binoculaire ds les gouttelettes d’eau de condensation sur le couvercle Examiner l’eau stérile issue de lavage de la surface,accumulée à la périphérie libre de culture Dispositif spécial permet d’éclaircir le fond du tube, examiner s/loupe Examiner le liquide à la loupe Examiner le culot de centrifugation du liquide s/loupe Recherche des larves

Méthode de Ho-Thi-SangMéthode de Harada et Mori Recherche s/loupe binoculaire ds les gouttelettes d’eau de condensation Examiner l’eau stérile issue de lavage de la surface,accumulé à la périphérie libre de culture Examiner le liquide à la loupe Examiner le culot de centrifugation du liquide s/loupe Recherche des larves

48h2-4j7 ème jLongévité Ankylostomes Larves strongyloïdes Infestantes entourées de leur mue ss que ceci nuire à leur mobilité 2-3semaines Anguillule Larves strongyloïdes, formes infestantes issues de transformation des larves rhabditoïdes Larves strongyloïdes + adultes mâle et femelle Larves strongyloïdes Infestantes nées des adultes libres non entourées de la mue de stade précédent 1semaine Culture positive

Cycle évolutif de Strongyloides stercoralis

Cycle évolutif des Ankylostomes

Référence : 1.Y.J.Golvan, P.Ambroise-Thomas. Les nouvelles techniques en parasitologie. Paris, ISBN: X. 2.Diagnostic de laboratoire en parasitologie, tome 1. 3.Anofel 4. 4.C. Moulinier. Parasitologie et mycologie médicales, éléments de morphologie et biologie. Paris, 2003.ISBN: V.Guillaume. Fiches pratiques parasitologie. INSB Paris, J.C.Pitithory.Cahier de formation biologie médicale N°11 septembre 98 - amibes et flagellés intestinaux, amibes oculaires leur diagnostic microscopique - septembre I. Achir, B.Hamrioui. Grands cours d’institut Pasteur d’Algérie, La coprologie parasitaire, parasitologie pratique.