Gérald AUBERT CHU Saint-Etienne DESC Réanimation Médicale Inter-Régions Rhône-Alpes et Sud-Est Mardi 9 juin 2009 Mécanismes de résistance aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa Gérald AUBERT CHU Saint-Etienne

Pseudomonas aeruginosa 1 – Mécanismes de résistance aux antibiotiques Rappels et nouveautés 2 – Activité des antibiotiques sur P. aeruginosa Etude des phénotypes 3 – Cas particulier de la Mucoviscidose Production de biofilm 4 - Impact d’un schéma thérapeutique Sélection de souches résistantes 5 – Comment éviter la sélection de mutants résistants Notion de PK/PD

1 – Résistance aux antibiotiques Origine : naturelle et/ou acquise

1 - 1 - Origine naturelle Constitutive - intrinsèque : résistance commune à toutes les souches d’une même espèce → Phénotype sauvage ex: Membrane externe des bacilles Gram négatif (LPS) empêche la pénétration des antibiotiques lipophiles (acide fusidique) et des antibiotiques de masse moléculaire élevée ne pouvant emprunter la voie des porines (pénicilline G, V et M - glycopeptides) La perméabilité membranaire de P. aeruginosa est de 10 à 100 fois inférieure à celle d’E. coli

1 - 2 - Origine acquise Résistance propre à certaines souches ayant par rapport à l’espèce à laquelle elle appartient un comportement différent vis à vis des antibiotiques. C’est le résultat de modifications génétiques : * Mutations affectant des gènes naturellement présents sur le chromosome bactérien * Acquisition de gènes “ étrangers ” provenant d’autres espèces ou portés par des éléments mobiles (plasmides ou transposons)

Transposon présent soit sur le chromosome, soit sur un plasmide Gènes « sauteurs » Transposon présent soit sur le chromosome, soit sur un plasmide Transfert RS vertical Chromosome (AmpC) Transfert RS horizontal Plasmide (BLSE) Bactérie

1 - 3 – Mécanismes de résistance Bactéries à Gram positif Bactéries à Gram négatif Inactivation de l’antibiotique + Inactivation de l’antibiotique +++ Modification de la cible ++ Modification de la cible + Efflux + Imperméabilité ++

Mécanismes de résistance - Inactivation de l’antibiotique C’est un mécanisme fréquent. Il s’agit d’une destruction de l’antibiotique. Ex : Hydrolyse des ß-lactamines par les ß-lactamases - Modification de la cible Généralement on observe soit une modification partielle de la cible, soit une modification du nombre de PLP Ex : modification des PLP chez le pneumocoque induisant une résistance aux ß-lactamines

- Diminution de la perméabilité La baisse de perméabilité entraîne une diminution de la quantité d’antibiotique atteignant la cible. * Protection de la cible Augmentation de l’épaisseur de la paroi (remodelage du peptidoglycane) Ex : Staphylococcus aureus de type GISA (résistance partielle aux glycopeptides) * Fermeture des porines Concerne surtout les bactéries à Gram négatif Ex : résistance à l’imipénème par fermeture de la porine D2 chez Pseudomonas aeruginosa

Exemple de modification de la perméabilité Porine D2 (OprD): seule voie de pénétration de l’imipénème chez P. aeruginosa Gram Négatif Porine

- Efflux actif Les systèmes d’efflux sont constitués de protéines particulières permettant l’expulsion de molécules (nocives) dont les antibiotiques dès qu’ils entrent dans la cellule bactérienne. Activation de l’efflux : diminution de la quantité d’antibiotique atteignant la cible. Les modifications de la perméabilité membranaire et l’efflux actif peuvent concerner des antibiotiques très variés (quinolones, tétracyclines, ß-lactamines...) et sont souvent impliqués dans la multirésistance. Chez P. aeruginosa : 12 systèmes d’efflux actifs dont 2 impliqués dans la résistance naturelle (MexAB-OprM ou MexXY-OprM).

Résistance par diminution de l’accumulation intrabactérienne Rejet à l’extérieur des antibiotiques : système de pompe mexA mexB oprM mexR - M. plasmique M. externe H+ OprM MexA MexB Protéine assurant la liaison entre les 2 membranes Canal protéique Pompe à efflux Energie : hydrolyse de l’ATP, gradient électrochimique de membrane Résistance: surexpression MexAB-OprM ou MexXY-OprM production MexEF-OprN ou MexCD-OprJ Mex : Multiple Efflux

Conséquences de la surexpression des pompes à efflux chez P. aerugionsa ß-lactamines Ticarcilline Aztréonam céfépime, cefpirome FQ Tétracyclines Aminosides MexA-B-OprM Constitutif MexX-Y-OprM Constitutif MexC-D-OprJ MexE-F-OprN

2 – Activité des antibiotiques sur Pseudomoas aeruginosa Etude des phénotypes de résistance Technique de l’antibiogramme (S/I/R) et/ou de la CMI (mg/L)

Antibiogramme Technique Vitek 2 Diffusion en gélose bioMérieux

Pseudomonas aeruginosa Résistance naturelle aux antibiotiques (imperméabilité membranaire) Pénicilline G et amoxicilline Amoxicilline + acide clavulanique C1G et C2G (Cefalotine, Cefoxitine, ….) Cefotaxime, ceftriaxone Tétracycline Quinolone 1ère génération Triméthoprime Nouveaux ATB inactifs : Tigécycline Ertapénème Moxifloxacine Daptomycine, Linézolide, … Nouvel ATB actif : doripéneme

Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Résistance naturelle : une céphalosporinase chromosomique ampC non inhibée par l’acide clavulanique une perméabilité limitée en raison du faible nombre de porines : vitesse de pénétration diminuée par rapport aux entérobactéries (10 à 100 fois moins) des systèmes d’efflux de bas niveau (MexAB-OprM et MexXY-OprM)

Antibiogramme de P. aeruginosa : phénotype de base Ticarcilline : S Pipéracilline : S Ticar + Ac clav : S Pipé + tazo : S Aztréonam : S Ceftazidime : S Céfépime : S Imipénème : S Méropénème : S Doripénème : S Tobramycine : S Amikacine : S Ciprofloxacine : S Colistine S

Phénotypes de Pseudomonas aeruginosa Phénotype Phénotype 2007 (CHU St-Etienne) sauvage Ticarcilline S I/R 39 % Ticarcilline + ac. Clav. S I/R 39 % Pénicillinases + Pipéracilline + tazo. S I/R 19 % céphalosporinase Ceftazidime S I/R 18 % haut niveau (ampC) Imipénème S R 9 % imperméabilité (oprD) Amikacine S R 20 % Tobramycine S R 11 % enzymes : AAC, APH … Ciprofloxacine S R 20 % mutation gyr A, parC, … Colistine S R 0 %

Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Résistance acquise : - enzymatique: - céphalosporinase hyperproduite (AmpC) - ß-lactamases à spectre étroit : pénicillinase (PSE/CARB, TEM-1 et TEM-2), oxacillinases ; - ß-lactamases à spectre étendu (BLSE) : - classe A : VEB-1, PER-1, GES-1, TEM-4 …, SHV-5 … - classe B : imipénémase * (metallo ß-lactamases) : IMP, VIM … * (sérine ß-lactamases) : KPC - classe D : OXA

Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Résistance acquise : - non enzymatique : - imperméabilité : porines Oprf et OprD2 - surexpression de l’efflux membranaire : MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN et MexXY-OprM - modification PLP

Antibiogramme de P. aeruginosa : phénotype résistant aux carbapénèmes Ticarcilline : S Pipéracilline : S Ticar + ac. clav : S Pipé + tazo : S Aztréonam : S Ceftazidime : S Céfépime : S Imipénème : R Méropénème : I/R Tobramycine : S Amikacine : S Ciprofloxacine : S Colistine S Imperméabilité (perte porine OprD2) et surexpression efflux MexEF-OprN ou MexAB-OprM (méropénème) L’imipénème n’est pas soumis au système d’efflux. Carbapénémase = métallo-enzyme IMP, VIM-1, VIM-2

Antibiogramme de P. aeruginosa : résistance par phénomène d’efflux membranaire Ticarcilline : I Pipéracilline : S Ticar + ac. clav : I Pipé + tazo : S Aztréonam : I Ceftazidime : S Céfépime : S Imipénème : S Tobramycine : S Amikacine : S/I Ciprofloxacine : I/R Colistine S Surexpression pompes à efflux : MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN et MexXY-OprM

Antibiogramme de P. aeruginosa : résistance de type céphalosporinase + ….. Ticarcilline : R Pipéracilline : R Ticar + ac. clav : R Pipé + tazo : I Aztréonam : R Ceftazidime : I/R Céfépime : I Imipénème : S Tobramycine : S Amikacine : S Ciprofloxacine : S Colistine S Hyperproduction de la céphalosporinase AmpC et éventuellement surexpression des pompe à efflux et/ou BLSE : VEB-1, PER, GES-1, TEM, SHV, OXA …

Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Mécanisme de résistance Tic Pip Caz Fep Atm IMI Absence S Pénicillinase R R/I I/S Efflux I/R S/I I Céphalosporinase hyper Déficit en porine D2 BLSE Imipénémase Tic : ticarcillline, Pip : pipéracilline, Caz : ceftazidime, Fep : céfépime, Atm : aztréonam, IMI : imipénème

Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux aminosides Deux mécanismes de résistance acquise (plasmide) : - enzymes inactivant les aminosides (nucléotidylation, phosphorylation ou acétylation). Résistance haut niveau. - diminution de l’accumulation de l’antibiotique dans la cellule par mutation du système de transport des aminosides. Résistance de bas niveau. Antibiotiques les plus actifs : amikacine et tobramycine

3 – Cas particulier de la mucoviscidose Le gène responsable de la maladie est localisé sur le chromosome 7au niveau du locus « CFTR ». Une mutation du gène provoque un mauvais fonctionnement de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Ce disfonctionnement affecte l'ensemble des glandes exocrines de l'organisme ainsi que des fonctions d'excrétion d'eau dans les épithéliums spécialisés.. Infection pulmonaire : cause de mortalité de la mucoviscidose Présence de sécrétions visqueuses et peu hydratées.

Infection à P. aeruginosa dans le cas de la MUCUVISCIDOSE : formation du biofilm Le biofilm se définit comme une population bactérienne qui adhère à une surface et s’enrobe d’une matrice d’exopolysaccharide (Alginate) Schémas et photos (prises en microscopie électronique) des différentes étapes de la formation du biofilm – Camille Mace

Cette photo prise au microscope électronique montre des bactéries regroupées (en biofilm) sur de la laine de verre. – Sébatien Vilain

Comportement de P. aeruginosa dans le cas de la MUCUVISCIDOSE Apparition de résistances et de facteurs de virulence lors de situations particulières in vivo : - présence de biofilm (exopolysacharide fabriqué lors de condition d’anaérobiose qui apparaît dans le la couche profonde du mucus) - hyper –expression des systèmes d’efflux - activation du quorum-sensing en phase stationnaire et en phase d’anaérobie Jeune biofilm de Pseudomonoas aeuginosa prise au microscope électronique à balayage © CNRS, Unité "Polymères, biopolymères, membranes"

Procédures d’adaptation chez P. aeruginosa Mucoviscidose et … Régulation par Quorum Sensing (QS) : processus de communication intercellulaire basé sur de petites molécules signal (langage) qui permet aux bactéries de répondre aux changements de l’environnement (phase stationnaire et anaérobiose) et de synchroniser de manière collective l’expression globale de multiples gènes (las et rhl). Le QS contrôle la synthèse de facteurs de virulence : - interviennent dans l’attachement bactérien et la colonisation (paroi): pili de type IV, flagelle … - sécrétés hors de la bactéries et provoquant des lésions cellulaires: exotoxine A, élastase, exoenzyme S, pyocyanine, pyocheline …

On estime que 6 à 10 % du génome de P. aeruginosa est régulé par le QS Les modèles expérimentaux (souris) et des souches mutantes confirment le rôle des facteurs de virulence et du QS dans la pathogénicité Les macrolides modulent la production d’exopolysacharides et de l’activité du QS Avenir thérapeutique : inhibition du QS pour diminuer la pathogénicité de P. aeruginosa S. Bleves et A. Lazdunski – Communication intercellulaire chez les bactéries – Qorum sensing. Bull. Soc. Microbiol., 2007, 22 : 227-233. Le Berre et al. Quorum sensing : une nouvelle cible thérapeutiquye pour Pseudomonas aeruginosa. Med Mal Infect. 2006, 36 : 349 – 357.

Traitement des infections à P. aeruginosa MUCUVISCIDOSE En anaérobiose : diminution de l’activité de tous les ATB En présence de biofilm + anaérobiose : aérosol Colistine - tobramycine Méropénème + tobra ou ciproflo Hill D., Rose B., Pajkos A. et coll. – Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aerugionsa isolates …… J. Clin. Microbiol., 2005, 43 : 5085 – 5090.

Pseudomonas aeruginosa Multi - résistance aux antibiotiques (totorésistance) Ticarcilline : R Pipéracilline : R Ticar + ac. clav : R Pipé + tazo : R Aztréonam : R Ceftazidime : R Céfépime : R Imipénème : R Méropénème R Tobramycine : R Amikacine : R Ciprofloxacine : R Colistine S/I Faire des CMI pour définir les niveaux de résistance … Etudier la rifampicine, la fosfomycine, …

4 - Impact d’un schéma thérapeutique L’exposition à l’imipénème (ou méropénème) et aux fluoroquinolones (ciprofloxacine) constitue un risque significatif pour l’émergence de souches résistantes (mutations ponctuelles). Situation : inoculum important 1010 UFC/mL Mais aussi : tazocilline et ceftazidime pour la résistance aux ß-lactamines K. Jennot et P. Plésiat – Implications thérapeutiques de la résistance aux antibiotiques chez Pseudomonas aerugionsa. La Lettre de l’Infectiologue. 2005, XX, n°6, 227-237 C. Pena et col – Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa: factors influencing multi-resistant acquisition in non-critically ill patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 28:519-522

CPM = CMI : 1011 CFU/mL CMI de la FQ pour le mutant de premier niveau CMI : 105 UFC/mL CMI de la FQ pour la population CPM = CMI : 1011 CFU/mL CMI de la FQ pour le mutant de premier niveau CMI = 0,023 mg/L Mutant chromosomique résistant de premier niveau (gyrA) Ex : E. coli CMI = 0,25 mg/L

CPM = CMI : 1011 CFU/mL CMI de la FQ pour le mutant de deuxième niveau CMI : 105 UFC/mL CMI de la FQ pour la population CMI = 0,25 mg/L Mutant chromosomique résistant de deuxième niveau (gyrA + parC) Ex : E. coli CMI = 1,5 mg/L

Quelques principes thérapeutiques … Eviter les antibiotiques peu actifs : céfotaxime, ceftriaxone, gentamicine, netilmicine, ofloxacine … Ne jamais prescrire en monothérapie : fosfomycine, fluoroquinolones, carbapénème … Faire une vraie antibiothérapie au niveau du site infectieux : - ß-lactamine + aminoside - ß-lactamine + ciprofloxacine Tenir compte du PK/PD des antibiotiques

5 – Comment éviter en clinique la sélection de mutants résistants Notion de PK/PD

Paramètres de pharmacodynamie Concentration d'antibiotique Concentration d'antibiotique Cmax Q.I.= C max CMI Cmax CMI Temps Temps Temps au dessus de la CMI ATB dose dépendant : aminosides - fluoroquinolones ATB temps dépendant : ß-lactamines

Notion de PK/PD Fluoroquinolones et aminosides (ATB dose dépendant) : Cmax/CMI = QI > 8 ß-lactamines (ATB temps dépendant) : T > CMI (50 % du temps entre 2 injections 4 à 5 CMI) Glyopeptides (ATB dose et temps dépendant) : C/CMI = 8 et AUC/CMI ≥ 400 A. P. MacGowan. Clinical implications of antimicrobial resistance for therapy. J. Antimicrob. Chemother. 2008, 62, Sup 2, ii105 – ii114.

Variation du PK/PD Paramètres : dose de l’ATB, volume de distribution (VD), clearence (Cl), liaison aux protéines, la variation de l’absorption, la valeur de la CMI.  VD Cl CMI Risque d’échec

CMI approchée de l’antibiotique Une souche bactérienne est considérée comme sensible à un antibiotique - Quelle CMI est à prendre en compte ? CMI approchée de l’antibiotique Technique de l’antibiogramme - Référence : la concentration critique basse - CMI réelle de l’antibiotique Technique E-Test (105 UFC/mL) Une souche de P. aerugionosa est sensible à la ceftazidime pour une CMI de 0,5 à 8 mg/L - CMI de l’antibiotique pour le mutant de premier niveau (FQ) présent dans l’inoculum (CPM) Technique avec 1011UFC/mL Une souche d’ E. coli sensible à la ciprofloxacine avec CMI = 0,75 mg/L a un CPM = 6 mg/L

0 1 2 3 4 6 8 Ex : E. coli

CPM de la rifampicine et de la ciprofloxacine pour S. aureus Concentration sérique de la rifampicine (mg/L) Concentration sérique de la ciprofloxacine (mg/L) 480 CPM 9,5 Fenêtre de sélection des mutants 6 A B CPM 4 Fenêtre de sélection des mutants CMI 0,3 CMI 0,003 Temps Temps RIFAMPICINE CIPROFLOXACINE Zhao X. and Drlica K. - J.I.D. 2002, 185 : 561-565

bithérapies (volumes de distribution des antibiotiques) CONCLUSION Pseudomonas aeruginosa Espèce peu sensible aux antibiotiques Fréquence importante de mutants résistants (10-7) Transfert conjugatif important des gènes et intégration sur le chromosome Attention : - aux inoculums importants (présence de mutants R) - aux posologies basses (sélection de mutants R) bithérapies (volumes de distribution des antibiotiques)