Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis

Les bactéries Gram négatives possèdent plusieurs systèmes pour transférer le matériel génétique. L’un de ces mécanismes est le système de conjugaison.

Ce mécanisme a été détourné par différentes bactéries pour d’autres transferts de macromolécules que celui de matériel génétique = système de sécrétion de type IV

Echantillon des systèmes de sécrétion de type IV (Covacci et al, 1999)

Schéma hypothétique du système de sécrétion de type IV chez Agrobacterium tumefaciens (Covacci et al, 1999) B1 Les composants du système de sécrétion sont codés par un opéron nommé virB

La bactérie d ’intérêt dans ce travail est Brucella suis La bactérie d ’intérêt dans ce travail est Brucella suis. - Coccobacille Gram-négatif - Zoonose affectant quelquefois l ’homme. - Pathogène intracellulaire - Famille des a-2 Protéobactériacées comme Agrobacterium tumefaciens Cette bactérie se développe, in vitro, dans les cellules HeLa et dans les macrophages, grâce à une déviation de la voie classique d’endocytose.

Dégradation enzymatique Vacuole de réplication Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp endocytose Interaction phagosome Brucella Autophagosome Endosome précoce Interaction Endosome tardif Reticulum endoplasmique Intervention du système de type IV Lysosome Dégradation enzymatique Vacuole de réplication

(O ’Callaghan et al, 1999) Les ORFs de ces deux opérons partagent un pourcentage d ’identité moyen de 26% (19,5 à 31 %)

Objectif de ce travail : Utilisation d ’une approche bioinformatique en vue de voir si on peut appliquer le schéma du système de sécrétion de type IV d’Agrobacterium tumefaciens à Brucella suis.

Les étapes suivies : 1) Collecter des informations au départ des séquences protéiques : - les localisations cellulaires - les motifs - les structures secondaires et tertiaires 2) Analyse plus approfondie de composants pour lesquels nous aurons pu proposer une fonction

La méthodologie : 1) Recherche d’homologues (Blast) - Banque non redondante - Banque de structures (PDB) - Banque d’ESTs humaines Les composants des systèmes de type IV La relation structure/fonction Interaction avec l’hôte 2) Prédiction de localisation sub-cellulaire (PSORT) - 4 localisations - Ne prédit pas encore la sécrétion - Prédictions fiables (cas-tests) - Localise une peu trop souvent en membrane interne

La méthodologie (suite) : 3) Détection de motifs a) Caractérisation d’une famille protéique (Blocks) b) Recherche de motifs fonctionnels (Prosite) 4) Prédiction de structures secondaires (PHD) - Localisation des structures secondaires - Prédiction d’hélices transmembranaires - Prédiction des résidus enfouis et exposés - Validation des localisations sub-cellulaires

La méthodologie (fin) : 5) Prédiction de structures tertiaires (3D-PSSM, Ucla-Doe) - Similarité de repliement protéique Relation structure / fonction

Agrobacterium tumefaciens Résultats du débroussaillage du système de sécrétion de type IV chez B. suis Agrobacterium tumefaciens Brucella suis B1

Conclusions du débroussaillage : - 8 protéines du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens peuvent être transposées à B. suis. - Des fonctions ont pu être proposées ou renforcées pour deux composants du système : VirB1 et VirB5.

La protéine VirB1 et son homologie avec les lysozymes

La fonction proposée, dans la littérature, pour VirB1 est la dégradation du peptidoglycane qui est aussi une des fonctions que remplissent les lysozymes.

Les topologies de VirB1 et du lysozyme sont comparables

Lysozyme complexé avec du NAG

La protéine VirB5 et son homologie avec la MAP1A (Microtubule Associated Protein 1A)

VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules. Domaines identifiés sur la MAP1A (2805 aa) (ProDom) PD000002 (K/R)(K/R)(D/E) Motif de liaison aux microtubules Ce qui s ’aligne À VirB5 N C VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules.

Ce bloc PD000002 est conservé par beaucoup d’autres familles protéiques. Il s ’agit en fait d’un coiled coil

Voici un échantillon des protéines qui partagent ce motif coiled coil: Protéines liant l’ADN : - protéines activatrices - élément de dimérisation de facteurs de transcription Apolipoprotéines Protéines fibreuses Famille des v-SNARE et t-SNARE Intéressant

Schéma d’interaction entre v-SNARE et t-SNARE Membrane vacuolaire Membrane organite RE, Golgi

Dégradation enzymatique Vacuole de réplication Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp endocytose Interaction phagosome Brucella Autophagosome Endosome précoce Interaction Endosome tardif Reticulum endoplasmique Intervention du système de type IV Lysosome Dégradation enzymatique Vacuole de réplication

Conclusions : - Nous avons pu transposer 8 composants du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens à B. suis. - VirB1 dégraderait le peptidoglycane - VirB5 est le candidat préférentiel pour le détournement du trafic intracellulaire - Discussion sur la méthode employée

Perspectives : - Validation de la fonction enzymatique de VirB1 en mutant les résidus conservés dans le site actif d’un lysozyme (mutagenèse dirigée) - Validation de la fonction de VirB5 par différentes manipulations (co-immunoprécipitation, …). - Analyse approfondie d’autres composants du complexe.