Principe de de la résonance plasmonique de surface Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre deux milieux d'indice de réfraction différent, une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l'interface et l'autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface. Lumière polarisée monochromatique Air Lumière réfléchie Plaque de verre Liquide Lumière réfractée

Principe (suite) Selon l'angle d'incidence du faisceau toute la lumière peut être réfléchie. Lorsqu'il n'y a pas de réfraction, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l'onde évanescente, se propage perpendiculairement à l'interface sur une distance équivalente à sa longueur d'onde. Lumière polarisée monochromatique Air Lumière réfléchie Q Liquide Onde évanescente

Principe (suite) I Air Qi Q Liquide Onde évanescente Si une couche fine de métal, riche en électrons libres est déposée à l'interface, ceux-ci entrent en résonance avec les photons du faisceau incident, ce phénomène est appelé résonance plasmonique de surface. Une conséquence énergétique de cette résonance est visible dans le faisceau réfléchi qui, analysé avec une barrette de diodes présente une chute d'intensité à un angle défini. Cet angle d'intensité minimum est l'angle de résonance. Il varie en fonction de l'indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent. Lumière polarisée monochromatique I Barette de diodes Air Lumière réfléchie Qi Plaque de verre Q Film d’or Liquide Onde évanescente

Principe de fonctionnement du Biacore Le Biacore a pour fonction de visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées dans un débit continu de tampon. Un des réactifs, le ligand, est retenu de manière spécifique sur une interface appelée sensor chip (biocapteur).

Le sensorgramme. L'analyte dilué dans un tampon circule à flux constant à la surface du biocapteur. Les changements de masse induits par l'association ou la dissociation des complexes modifient la réfringence du milieu et décalent la position de l'angle de résonance. L'enregistrement de la variation de l'angle de résonance permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur. Le signal de résonance est exprimé en unités de résonance (RU). L'enregistrement de ce signal s'appelle un sensorgramme. Une variation de 1000 RU correspond à une déviation de l'angle de 0,1 degré, ainsi qu'à une fixation de 1 ng de protéine par mm2 de surface.

Le cycle d’analyse en temps réel Ligand

Le cycle d’analyse Analyte

Le cycle d’analyse Phase d’association

Analyte + Ligand Complexe Le cycle d’analyse Analyte + Ligand Complexe

Le cycle d’analyse Phase de dissociation Tampon

La liaison analyte - ligand Le cycle d’analyse Analyse Mathématique Analyse cinétique de La liaison analyte - ligand

Le cycle d’analyse Agent régénérant Phase de régénération

Interactions en Temps Réel par BIACORE Molécules concernées protéines, acides nucléiques, sucres, lipides, petites molécules, drogues, peptides cellules, particules virales... Applications majeures Constantes d’affinités (KD=10-4 -10-12 M) et cinétiques (ka, kd) Concentration active d’un analyte Cartographie épitopique Validation de molécules recombinantes Détection de molécules (milieux complexes) Etude paramétrique Micropurification et récupération Monsieur le Président, Mesdames et Messieurs les membres du jury, tout d’abord, je voudrais vous remercier de l’opportunité que vous m’offrez de me présenter au concours d’IR en biologie, spécialisé en mesures d ’interactions par SPR

Nature Biotechnology  21, 71 - 76 (2003) Rational design of a CD4 mimic that inhibits HIV-1 entry and exposes cryptic neutralization epitopes Loïc Martin1, François Stricher1, Dorothée Missé2, Francesca Sironi3, Martine Pugnière4, Philippe Barthe5, Rafael Prado-Gotor5, Isabelle Freulon1, Xavier Magne2, Christian Roumestand5, André Ménez1, Paolo Lusso3, Francisco Veas2 & Claudio Vita1

Interaction protéine-virus : HIV MiniCD4 protéine mimétique (3kD) faite par synthèse peptidique à partir d’un fragment de toxine de scorpion donnant les caractéristiques structurales du CD4 Objectifs de l ’étude Etude des interactions entre gp120 et miniCD4 Démontrer que miniCD4 peut démasquer des épitopes neutralisants de la gp120 rec. et sur la gp120 native BIACORE Etroite collaboration avec F.Veas et C. VITA. Loïc Martin est venu se formait chez nous Martin L, Stricher F, Misse D, Sironi F, Pugnière M, Barthe P, Prado-Gotor R, Freulon I, Magne x, Roumestand C,Menez A, Lusso P, Veas F and Vita C. (2003). Nat Biotechnol 21(1): 71-6

STRUCTURE DU VIH core gp120 enveloppe P7 (nucléocapside) gp41 P24 intégrase P17 (matrice) RT ARN protéase 90 à 120 nm

HIV Lifecycle Rambaut A. et al. Nat. Rev. Genet. 5:52-61, 2004

Entrée du virus dans la cellule : 1re étape du cycle de réplication virale Interaction entre le complexe trimérique de l’enveloppe et le récepteur CD4 modification conformationnelle de la gp120 et de la gp41 augmentation de 100 à 1 000 fois de l’affinité pour le corécepteur Cellules infectées ou exprimant des protéines de l’enveloppe virale Glycoprotéines de l’enveloppe VIH CD4 L’entrée du virus dans la cellule est une des étapes clés du cycle de la réplication virale. Cette étape commence par l’interaction entre le complexe trimérique de l’enveloppe virale et le récepteur CD4. Cette première phase conduit à des modifications conformationnelles de la gp120 et de la gp41 et à une augmentation de l’affinité pour le corécepteur. La seconde phase consistant dans la fixation du virus avec le corécepteur permet de terminer les changements de conformation de la gp41 nécessaires à la phase ultime, celle du rapprochement des deux membranes cellulaire et virale pour permettre la fusion. CCR5 ou CXCR4 (corécepteur) Cellules cibles exprimant CD4 et corécepteur CROI 2003 - D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé

Les différentes étapes déclenchant la fusion 2 Attachement cellulaire non spécifique Fixation au récepteur CD4 Initiation de la modification conformationnelle de l’enveloppe Fixation au corécepteur Fin de la modification conformationnelle de l’enveloppe Formation d’une structure en épingle à cheveux, hélicoïdale avec rapprochement des membranes Initiation de la fusion des membranes lipidiques Cellule cible Corécepteur CD4 gp120 gp41 Voir commentaires diapositive précédente. Virus Étapes possibles du blocage de l’entrée 1. Inhibition de la fixation au CD4 2. Inhibition de la fixation au corécepteur 3. Inhibition de la modification conformationnelle de la gp41 (fusion) - D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé

Structure of HIV-1 gp120/CD4 Complex Blue: glycosylation sites

STRATEGIES ANTI-VIH : bloquer les étapes ARN viral gp120 CD4 ADN proviral ADN intégré Rétro Transcriptase protéines Inhibiteurs de la fusion Inhibiteurs de la RT Analogues nucléosidiques Non nucléosidiques Inhibiteurs de l’intégrase Inhibiteurs de la transcription ARNm Inhibiteurs de l’assemblage Inhibiteurs de protéase GC/VIH/99

Synthétiser une mini proteine qui mime CD4 et qui inhibe l’entrée de HIV dans la Cellule

Interaction protéine-virus :HIV interaction : gp120 sur CD4M33 immobilisé Les gp120 se lient au CD4M33 Interactions Moléculaires en Temps Réel (M. Pugnière, F. Roquet) CNRS-UMR 5160 site CRLCC Val d’Aurelle

Interaction protéine-virus :HIV Le CD4M33 induit les changements de conformation de la gp120 HXB2 soluble ou de la gp120 portée par les particules virales nécessaires pour exposer les épitopes du 48D et du 17B. + CD4s ou M33 - CD4 ou +M0 gp120WT-CD4 / 48D Part. virales+CD4 / 48D +M33 Interaction protéine-virus :HIV

Conclusions --Elles amènent une quantification de l’affinité mais surtout des données cinétiques. -Etude des interactions à plus de deux partenaires -Etude paramétrique de ces interactions -Méthode applicable à grand nombre de molécules et aux interactions complexes -Récupération possible