Centre hospitalier du pays d’Aix LE B. A. BA de la bactériologie : On ne trouve que ce que l’on cherche….. Dr O. BELLON Centre hospitalier du pays d’Aix

Pourquoi prélever? Prélèvements diagnostiques : fait ou confirme le diagnostic Précise le ou les microorganismes Permet de faire l’antibiogramme ou de connaître la sensibilité du germe Prélèvements épidémiologiques Prédictifs Suivi Relations avec le laboratoire +++

Pourquoi prélever? Uniquement les micro-organismes intéressants Patient Environnement Donc bon protocole de prélèvement Elimination des MO contaminants Elimination des MO colonisants Donc bonne prescription bien relayée…..

Pourquoi prélever? Relation avec les laboratoires +++

Exemple Monsieur DUPONT atteint d’une spondylodiscite Prélèvement bactériologique par ponction vertébrale Mis sous vancomycine (staphylocoque le plus probable) Cultures stériles en 15 jours……….

Secondairement nouveaux prélèvement pour culture pour recherche de BK……

Equilibre agression-défense Inoculum Voies aériennes stériles Défense Voies aériennes colonisées Inoculum Défense Défense Pneumonie Inoculum

Rôle du bactériologiste Isoler les germes tester la sensibilité et dépister les résistances (interprétation) aide à la mise en place d ’un traitement efficace suivi épidémiologique Fonction d ’alerte Avec ou sans germe isolé

Informatisation : intérêt Tableaux synthétiques sur les isolements d’un service Tendance évolutive de l’écologie Résistance aux antibiotiques Identification de phénomènes épidémiques Collaboration étroite entre équipe opérationnelle d’hygiène, le laboratoire de microbiologie et les services cliniques et outils informatiques performants

Prélèvements le biologiste s ’occupe : des prélèvements issus de malades diagnostic de l ’infection identification des BMR en routine des prélèvements à visée épidémiologique issus de malades ou de patients utilisation de milieux standards ou sélectifs des prélèvements d ’environnement milieux et techniques spécifiques

Prélèvements : qualité Patients ET environnement Qualité Prescription Prélèvement Transport Milieux ensemencés et atmosphères utilisées Germes étudiés Rendu des résultats Utilisation des résultats

Stratégie Quand prélever ? comment prélever ? comment analyser ? que faire du résultat ? Se référer au REMIC : référentiel de microbiologie de la Société Française de Microbiologie.

Le patient

Hémocultures

Quand prélever • Contexte Le sang est normalement stérile. La bactériémie correspond à la présence de bactéries dans le sang. Elle est confirmée par l’isolement d’un ou plusieurs germes pathogènes dans les hémocultures. L’entité clinique dénommée précédemment « septicémie » n’est plus utilisée à l’heure actuelle car elle associait deux entités différentes : d’une part un état bactériémique prolongé, d’autre part un état infectieux qui, suivant les cas, pouvait aller du sepsis simple au choc septique.  

  Prélèvement Pour tous les établissements de santé, le protocole de prélèvement des hémocultures doit être validé par le CLIN.  Un prélèvement d’hémoculture correspond à l’ensemencement de 1, 2 voire 3 flacons prélevés au cours d’une même ponction, selon que l’on recherche des bactéries aérobies, anaérobies voire des levures ou des champignons.

Mode de prélèvement Il est impératif de limiter la contamination microbienne du prélèvement de sang du préleveur au sang (VHC, VIH). Les principales étapes sont les suivantes : désinfection de l’opercule des flacons désinfection du point de ponction avec un produit adapté ; lavage ou désinfection des mains du préleveur ; port de gants ; ne plus palper la veine après cette étape ; prélever le sang identifier correctement l’ensemble des flacons.

Mode de prélèvement La ponction veineuse est la seule méthode valable pour prélever le sang en vue de sa mise en culture. Les autres sites de prélèvement, notamment les recueils de sang à travers un cathéter, augmentent de façon significative la fréquence des contaminants.

Quantité de sang prélevé La quantité de sang à prélever doit être suffisante. En effet, la densité des bactéries présentes dans le sang est généralement très faible chez l'adulte, de l’ordre de 1 UFC/ml au cours des épisodes bactériémiques. Il existe une relation directe entre le volume de sang inoculé dans les flacons d'hémoculture et le rendement de la technique. Un volume de 20 ml de sang prélevé augmente le pourcentage de positivité. 

Prélèvement

prélèvement

Cultures Intérêt du prélèvement en flacon anaérobie permet la culture des bactéries anaérobies strictes (agents étiologiques importants après chirurgie digestive et gynécologique) les streptocoques poussent mieux en atmosphères anaérobies augmente la sensibilité du prélèvement (par l'augmentation du volume de sang prélevé) Composition du milieu de culture nutriments Anticoagulants agents neutralisant les antibiotiques (résines) Existence de milieux spéciaux pour la recherche de mycobactéries, de champignons.  

Cultures Durée de la culture 5 jours dans la majorité des cas 10 jours pour la culture de levures 28 jours pour la recherche des bactéries du groupe HACEK responsable d'endocardite (Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis, Eikeinella corodens, Kingella kingae) 42 jours pour la recherche de Brucella, Legionella.  

Méthodes de culture Systèmes manuels Systèmes automatiques en flacons liquides ou bi-phasiques. - Incubation 7 jours à 35°C. - Mirage (observation) tous les jours (recherche de trouble, d'hémolyse, de surpression, de coagulation…). Systèmes automatiques Détection facilitée, Incubation 5 jours à 35°C. Détection automatique de la pousse bactérienne variation de fluorescence ou du pH du milieu de culture, qui fait suite à la production de CO2 par les bactéries. Détection par infra-rouge possible.

Traitements des hémocultures positives au laboratoire Examen direct coloration de Gram / dans l'heure qui suit la détection par l'automate : TELEPHONE AU MEDECIN Orientation diagnostic : bacilles ou coccis, Gram +/- Identification de l'espèce et antibiogramme disponibles le lendemain.

Au laboratoire

Interprétation Plusieurs hémocultures positives avec la même bactérie : la bactérie identifiée était dans le sang du patient. Une seule hémoculture positive avec un germe pathogène strict : la bactérie identifiée est très probablement dans le sang du patient (dans plus de 90 % des cas) Une hémoculture positive avec une bactérie de la flore cutanée : probablement un contaminant dans plus 80 % des cas).  

Interprétation Hémocultures négative malgré contexte d’infection : Prélèvement insuffisant ? Traitement antibiotique ? Bactérie ne poussant pas dans le milieu ? Legionella, Mycoplasmes, Leptospira, Bartonella, mycobactéries.  

Le prélèvement Comment ? Quelle quantité ? Quand ? Combien ? Stérilité absolue Ponction veineuse (éviter les cathéters, si possible) Quelle quantité ? Adulte : 10 à 20 ml (bactériémie maximale : 1 bactérie/ml) Enfant : 1 à 2 ml (densité plus importante) Quand ? Pendant ascension thermique ou pic fébrile. Avant traitement antibiotique si possible (ou pendant vallée). Combien ? 2 à 3 par séries/ jour . 30 à 60 minutes minimum entre chaque. Flacons aérobie et anaérobie la première fois Possibilité de prélever les 6 flacons en même temps si le nombre de contamination dans la structure est important.

Résultats 1745 flacons étaient positifs 1497 : positifs vrais 248 : contaminés Un germe pathogène ou susceptible de l’être à été retrouvé dans seulement 7.6% des flacons prélevés (6.4% en 2005). Dr O. BELLON CLIN CHPA 06/2008

Poids des hémocultures Flacons aérobie : Sur 63 flacons pesés : 21 corrects (33%) 5 au moins 10 ml 16 ente 5 et 10 ml 42 incorrects 22 moins de 2 ml……….dont 68% moins de 1ml Flacons anaérobie : Sur 64 flacons pesés : 16 corrects (25%) 3 au moins 10 ml 13 ente 5 et 10 ml 48 incorrects 25 moins de 2 ml……….dont 50% moins de 1ml

Cathéters

Quand prélever Cathéter seulement en cas de suspicion d ’infection pas de prélèvement systématique ++++

Bonnes pratiques de prélèvement Cathéter désinfection préalable retirer le cathéter de façon aseptique couper les 5 derniers cm STERILEMENT mettre dans un pot STERILE 1 cathéter par pot ++++ que le bout de cathéter pas le buterfly…….. pas le sparadrap…...

cathéters Multiplicité des « cathéters » Intra-vasculaires ou non Hétérogénéité des prélèvements malgré un même protocole

Bonnes pratiques de prélèvement Cathéter apport rapide dans le laboratoire moins de 2 heures dessiccation facile multiplication dans le sang coagulation dans le cathéter noter tous les éléments nécessaires au biologiste +++++

Analyses au laboratoire Cathéter plusieurs techniques possibles problème de sensibilité et de spécificité que cherche-t-on ? les germes externes les germes internes les deux cathéter en place ou enlevé

Analyses au laboratoire Cathéter : matériel en place hémocultures différentielles surtout pour les cathéters profonds et les chambres implantables hémocultures simultanées (ou <2 heures) périphériques sur matériel rapidité de la culture ou numération prévenir le biologiste ++++

Analyses au laboratoire Cathéter : matériel enlevé culture avec NUMERATION techniques de MAKI CLERI BRUN-BUISSON

Interprétations : cathéters 4 situations classiques doivent être distinguées contamination du cathéter colonisation du cathéter infection clinique sur cathéter infection bactériémique sur cathéter

Interprétations : cathéters situations classiques définies à partir : bactériologie prélèvement cathéter hémocultures différentielles NUMERATION +++++ clinique signes locaux signes généraux autres sites infectés

Interprétations : cathéters contamination du cathéter culture positive mais à un TAUX NON SIGNIFICATIF intérêt de la numération +++ ABSENCE DE SIGNES CLINIQUES locaux ou généraux

Interprétations : cathéters colonisation du cathéter culture positive taux significatif >15 ou >1000 selon la technique ++++ intérêt de noter la technique sur le compte rendu clinique Absence de signes cliniques GENERAUX signes locaux possibles mais limités à un érythème

Interprétations : cathéters infection clinique sur cathéter culture positive taux significatif PRESENCE de SIGNES CLINIQUES locaux ou généraux diminution ou disparition des signes à l ’ablation du cathéter

Interprétations : cathéters infection bactériémique sur cathéter cultures positives à un taux significatif pour le cathéter d ’une hémoculture même germe pas d ’autre foyer infectieux à ce même germe

Interprétations : cathéters Les situations ne peuvent jamais être définies en l ’absence de l ’examen clinique : liaison clinico-biologique ou biologico-clinique OBLIGATOIRE

Urines

L’infection du tractus urinaire (ITU) est une des infections les plus fréquentes Cela explique que l’examen cytobactériologique des urines (ECBU) soit une des analyses microbiologiques les plus demandées. Son apparente simplicité d’exécution ne doit pas faire oublier qu’il convient de respecter en toute circonstance une méthodologie rigoureuse.

Nourrisson Chez le petit enfant, on doit utiliser un collecteur stérile spécifique. Ce dispositif à usage unique adapté à l'anatomie se pose après désinfection soigneuse du périnée et ne peut être laissé en place plus de 20 à30 minutes. Passé ce délai, si l'enfant n'a pas uriné, le dispositif est éliminé et remplacé par un collecteurneuf. Dès la miction terminée, le collecteur est ôté et les urines sont transvasées soigneusement dans un flacon stérile puis acheminées rapidement vers le laboratoire.

Urétérostomie (sans sonde) Après nettoyage soigneux de la stomie, on met en place un collecteur stérile et l'on procède comme pour le nourrisson.

Recherche de mycobactéries Cet examen de seconde intention exécuté sur prescription spécifique ultérieure au vu des premiers résultats de la recherche de bactéries banales, doit être effectuée sur la totalité de la première miction du matin, trois jours de suite Après restriction hydrique.

Recueil des urines chez le patient incontinent Le recueil d’urines par sondage urinaire à l’aide d’une sonde de petit calibre n’est acceptable que chez la femme si le recueil des urines lors de la miction st impossible. Même chez la femme incontinente, le cathétérisme n’est pas indispensable et un prélèvement après toilette génitale soigneuse peut être considéré comme acceptable. Chez l’homme, afin d’éviter les prostatites, on préférera e recueil par collecteur pénien propre, voire par cathétérisme sus-pubien en cas de rétention d’urine.

Circonstances particulière Urines du premier jet (après éventuel massage prostatique) Ce mode de prélèvement est intéressant en cas de uspicion d'infection uréthrale ou prostatique. Il eut être aussi utilisé pour la recherche de mycoplasmes u de Chlamydia trachomatis par diagnostic énotypique.   .

Examen cytobactériologique Examen cytologique Aspect quantitatif on dénombre les différents éléments figurés contenus dans un volume donné de l'urine à étudier. Leur nombre est rapporté au millilitre. Aspect qualitatif En cas d'infection urinaire, le processus inflammatoire e traduit par la présence de : ≥ 104 leucocytes / ml, parfois en amas ; ≥ 104 hématies / ml, témoins de microhémorragies; cellules du revêtement urothélial.

criblage rapide par bandelettes "au lit du malade ». une valeur prédictive négative de 95% chez le patient non sondé. Cette méthode de dépistage n’est pas utilisable chez es patients sondés du fait de la présence habituelle de leucocytes chez les patients avec une vessie neurologique qui présentent une leucocyturie chronique.

Mise en culture Dénombrement des microorganismes L'évaluation quantitative de la bactériurie peut s'opérer par dilution des urines ou par technique de l'anse calibrée ou par méthode de la lame immergée. Après 24 h d’incubation, voire 48 h si nécessaire,  Identification et antibiogramme

Interprétation renseignements concernant la clinique, prélèvement et le transport Bactériurie - < 103 CFU / ml : absence d'infection ; - > 105 CFU / ml : infection probable ; - Entre 103 et 105 CFU/ml : zone d'incertitude, variable avec le caractère communautaire ou nosocomial de l’infection… En théorie, l’interprétation s’effectue en prenant en compte la combinaison des quatre paramètres : Bactériurie quantitative, leucocyturie quantitative, Symptômes urinaires et pathogénicité reconnue de la souche isolée.

Quand prélever Sonde urinaire ne pas prélever la sonde prélever les urines CORRECTEMENT prélèvement le plus fréquent banalisé souvent mal fait

Quand prélever Sonde urinaire colonisation rapide variable avec la matériau latex silicone contamination rétrograde pose après la pose système non clos, sans valve anti-retour

Bonnes pratiques de prélèvement Urine jamais dans le sac collecteur ne pas rompre le système clos ponction au niveau de la sonde site de prélèvement ponction de la sonde désinfection du point de prélèvement +++ recueillir l ’urine au changement de sonde +++ ponction sus-pubienne problème des sondes d ’urétérostomies

Bonnes pratiques de prélèvement Urine apport rapide dans le laboratoire multiplication +++ à température ambiante X 10 en 1H X 100 en 2H ……….. À 37°C conserver à 4°C mais problème du pyocyanique noter tous les éléments nécessaires au biologiste +++++ CBU sur sonde : seuil d’étude différent CBU sur néphrostomie : seuil plus bas ++++

Analyses au laboratoire Urines : numération des cellules leucocytes hématies cristaux cylindres culture avec numération (compte de KASS lame immergée 10 microlitres ou 1 microlitre germes banaux

Interprétations :urines Classiquement en fonction : nombre de leucocytes numération des germes < 1000/ mL > 100 000/ mL <10 si ponction suspubienne….. nombre d ’espèces isolées mono, bi, tri ou plus Clinique +++++

Interprétations :urines Nombre de leucocytes non utilisable en cas de sonde : leucocyturie réactionnelle Nombre de bactéries et d ’espèces Se référer aux différents consensus ++++

Interprétations :urines Signes cliniques symptomatologie urinaire patente dysurie pollakiurie pesanteur vésicale hématurie macroscopique évocatrice incontinence douleur lombaire hyperthermie

Interprétations :urines Signes cliniques symptomatologie trompeuse protéinurie personne âgée nourrisson diabétique cas des CBU systématiques femme enceinte bilan pré-opératoire contrôle post-thérapeutique

Interprétations :urines ATTENTION +++++ numérations valables uniquement si : conditions de prélèvement aseptiques ++++ transport rapide au laboratoire ensemencement rapide au niveau du laboratoire notion de sondage explicitement donnée au laboratoire

Pus

Prélèvement et transport La recherche de bactéries particulières doit faire l’objet de procédures spécifiques mycobactéries,Brucella spp., Neisseria gonorrhoeae, Borrelia burgdorferi, Campylobacter, Legionella,Mycoplasma spp., Les prélèvements doivent être acheminés le plus rapidement possible au laboratoire (moins de 2 h à 20°C) pour éviter la dénaturation des cellules ou la mort des bactéries.

Prélèvement et transport Ces prélèvements doivent être réalisés si possible avant toute antibiothérapie, dans des conditions très strictes d’asepsie, après désinfection soigneuse de la peau pour éviter toute contamination par la flore commensale cutanéomuqueuse au point de ponction Les prélèvements effectués au bloc opératoire doivent être privilégiés, savoir les répétér Les accompagner de renseignements cliniques surtout lors de suspicion d’infection ostéoarticulaire.

Prélèvement et transport la quantité de liquide ponctionné doit être suffisante : examens cytologique, bactériologique, biochimique et anatomopathologique. Les prélèvements à l’aide d’écouvillons secs sont à déconseiller formellement. Le conditionnement de ces liquides doit garantir la survie des bactéries anaérobies strictes. En cas de suspicion d’infection, associer aux prélèvements deux flacons d’hémocultures (aérobie et anaérobie)

Examen bactériologique Examen macroscopique Examen microscopique Culture Sensibilité aux antibiotiques Interprétation  

REMIC Le nouveau REMIC a été publié fin 2010 Augmentation des recommandations pour la phase pré-analytique

L’environnement Eaux Air Surfaces Méthodologies particulières Milieux différents de ceux utilisés pour les bactéries provenant des hommes

Hospital environment La contamination de l’environnement est fonction de la quantité de germe apportée, de la capacité de Prolifération et de survie dans l’environnement et de la quantité de germes retirée.

Surfaces Combien de temps survit sur une surface séche : Virus HIV? Hepatite C? Bactérie S. aureus? Acinetobacter? Clostridium difficile?

Surfaces (A)

Hôpital : environment   Caractéristiques particulières des germes de l’environnement : Souvent multirésistants aux antibiotiques...... Mais peu virulents. Préfèrent des températures d’incubation basses pour pousser Ne poussent pas forcément sur les milieux riches utilisés en pratique médicale Poussent lentement Milieux spécifiques préférables : TS (R2A) à garder plus longtemps pour amléliorer la sensibilité....

Milieux Aux milieux de culture doivent être associées des substances capables de neutraliser les détergents/désinfectants utilisés lors des opérations de nettoyage Tween 80, lécithine, L-Histidine, etc.. Le plus souvent en mélange

Milieux Incubation Flore bactérienne aérobie mésophile : Champignons : pendant 3 jours minimum. Champignons : 25°C pendant 5 jours minimum

Au total La contamination de l'environnement hospitalier varie : qualitativement et quantitativement d'un établissement à un autre, et au sein d'un même établissement, en fonction des services, des patients, des soins pratiqués, de la capacité de survie des micro-organismes dans l'environnement Et de la qualité de l’entretien chaque établissement de santé doit adapter la stratégie de contrôle de son environnement, en fonction de zones à risque zones définies par le CLIN et l ‘équipe opérationnelle d’hygiène.

Au total : maîtrise maîtrise de l'environnement indispensable : protection des patients (fragiles) et du personnel. repose sur la mise en œuvre de démarches d'analyse des risques : définition de niveaux de qualité requis adaptés à chaque type de situation. La stratégie de surveillance = démarche raisonnée : prélèvements microbiologiques seulement si réellement utiles actions à mener sur la base des résultats des analyses indicateurs en priorité, contrôles des procédés.

limites pour chaque type de contrôle, l’établissement de soins retient : des méthodes de prélèvement et d’analyse si possible normalisées ou à défaut standardisées ; des critères d’interprétation à 3 niveaux : cible, alerte action. établis en tenant compte de la réglementation existante, de recommandations ou à défaut définis par l’utilisateur

limites Le niveau cible Le niveau d’alerte Le niveau d’action niveau de qualité qui vise à assurer et à maintenir des conditions normales de fonctionnement dans le contexte d’un environnement maîtrisé. Le niveau d’alerte niveau permettant une première alerte en cas de dérive par rapport aux conditions normales . Dépassement : vérifier les résultats observés et de s’assurer que le processus et/ou l’environnement sont toujours maîtrisés. Délais d’analyse : les premières mesures correctives peuvent être prises. Le niveau d’action est le niveau devant impérativement déclencher, lorsqu’il est dépassé, une réaction immédiate avec analyse des causes du dysfonctionnement et mise en œuvre d’actions correctives.

Types de prélèvements procédure de qualification d’une installation, avant le démarrage, dans un nouvel environnement à visée de surveillance cadre du plan de maintenance d'une installation de points critiques : établissement du niveau de base et suivi cadre de travaux : évaluation du niveau de risque. à visée d’investigation si orientation vers une contamination environnementale : recherche de la source de contamination afin de la supprimer. Recherche d’un réservoir secondairement environnemental pédagogique pour visualiser la présence de micro-organismes dans l'environnement.

recommandations organisation La documentation concernant l’ensemble des éléments concernant la vigilance environnementale Y COMPRIS LES SURFACES est réunie dans un dossier mis à jour périodiquement et mis à la disposition de l’équipe opérationnelle d’hygiène. Une fiche formalisant la définition des responsabilités et le rôle des différents acteurs concernés est incluse dans ce dossier. dans les établissements de santé de grande taille, instance interne de coordination dont les interlocuteurs de référence sont CLIN EOH les services techniques de l’établissement.

Conclusions Ne prélever que si c ’ est nécessaire respecter les conditions de prélèvement et de transport analyser et interpréter en fonction de la clinique étudier à mauvais escient peut entraîner des erreurs de diagnostic un traitement antibiotique non nécessaire peut être dangereux pour le patient et/ou l ’environnement (population)