Quels examens de biologie moléculaire prescrire et obtenir en 2011? I Rouquette

Plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers Elles ont pour vocation de réaliser les tests moléculaires innovants pour l’ensemble des patients de la région, quel que soit l’établissement où ils sont pris en charge, CHU, CLCC, CH ou établissement privé. Plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers

Plateforme de génétique moléculaire des cancers Directeur de plateforme: E Delabesse Trois sites: Rangueil I Rouquette: poumon EGFR/ALK/BRAF/HER2 ICR G Favre PI3K poumon Purpan J Selves Lamant: colon mélanome E Delabesse: BCR ABL/KIT

A Rangueil 2005 projet ligue: séquençage de 100 patients acquisition d’une expertise formation technicien Tenon 2007 demande d’activité nouvelle: acquisition d’équipements et budget fonctionnement sur 2 ans pour commande réactifs 2009 : intégration plateforme biologie moléculaire des cancers du CHU (E Delabesse) 2009 ORPAMIP: Structuration de la biologie moléculaire.(Kras, EGFR, MSI, 1p19q). 2010: Subvention EGFR INCa: pas de facturation clinicien patient, remboursement déstockage 2011: subvention INCa biomarqueurs émergents

AUJOURD’HUI Une AMM première ligne: gefitinib Une ATU: Crizotinib Des essais cliniques plus ou moins avancés Un seul examen aujourd’hui indispensable pour guider la conduite thérapeutique: recherche des mutations activatrices d’EGFR

GEFITINIB (IRESSA®) is indicated for the treatment of adult patients with locally advanced or metastatic non small cell lung cancer (NSCLC) with activating mutations of EGFR.

48% 3% 5% 3%

2142 adénocarcinomes exon 19 et L858R Incidence of EGFR Exon 19 Deletions and L858R in Tumor Specimens From Men and Cigarette Smokers With Lung Adenocarcinomas Sandra P. D’Angelo et al J Clin Oncol 2011

Indications Financement INCa: Tous les patients atteints d’un adénocarcinome du poumon devraient pouvoir avoir accès au test EGFR pour déterminer le statut mutationnel de leur tumeur. Non acceptés par la plateforme: épidermoïdes du fumeur, NEGC Acceptés après discussion: épidermoïdes du non fumeur, adéno-squameux, CNPC.

Circuit des examens de biologie moléculaire Pathologiste détenteur du matériel CHG, CHU, Secteur Privé Pathologiste de la plateforme

Contrôle morphologique Extraction d’ADN PCR Criblage Séquençage des variants 12 12

BILAN EGFR 2010 Trimestre 1 Trimestre 2 Trimestre 3 Trimestre 4 Nb patients 464 88 115 147 Nb examens 522 89 149 127 157 % mutations 17,05 12,17 9,57 11,56 Délai de rendu 15 jours 11 jours 9 jours % Prescriptions secteur privé 37,5 26,96 45,22 51,02 % Non interprétables 2,27 13,91 6,96 4,08

2009 2010 2011 PATIENTS TESTES 55 422 600 Trois premiers trimestres % MUTES 23% 9,5 à 17% 7 à 11%

Un rapport de synthèse concernant les tests de génétique moléculaire pour l’accès aux thérapies ciblées a été rédigé

une altération moléculaire peut être identifiée chez environ 40 % des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules. 20-30% 12-14% 5%

Translocation EML4-ALK 81 Activité de l’inhibiteur oral de ALK, le PF-02341066, dans une population de CBNPC positifs pour ALK (n = 82) 60 Progression 40 Stabilité Réponse partielle confirmée 20 Réponse complète confirmée Variation maximale de la taille tumorale (%) -20 -30 % -40 Quatre vingt-deux malades ont été sélectionnés par une méthode de FISH et inclus dans la phase II. Les effets indésirables les plus fréquents étaient des troubles digestifs (~50 %) et des troubles visuels (~40 %). Il y a eu 12 % d’effets indésirables de grade 3 (essentiellement élévation des transaminases) et un seul malade a eu une élévation des transaminases de grade 4. Le taux de réponse objectif est de 57 %, avec 87 % de malades contrôlés à 8 semaines. La survie sans progression à 6 mois a été estimée à 72 % pour une durée médiane de traitement de 5,7 mois (1 à 15 mois) ; 68 % des malades (n = 13) ont interrompu le traitement du fait d’une progression. -60 -80 Taux de réponse = 57% Contrôle à 8 semaines : 87 % SSP à 6 mois : 72 % -100 Kwak, NEJM 2010 19

(echinoderm michrotubule associated protein like 4) Protéine de fusion EML4-ALK: partie N-term. EML4 (echinoderm michrotubule associated protein like 4) + portion intracellulaire du récepteur tyrosine-kinase ALK (anaplastic lymphoma kinase) inversion du bras court du chromosome 2 [Inv(2)(p21p23)] qui fait joindre exons 1–13 de EML4 aux exons 20–29 de ALK. 20

Split signal en FISH FISH: examen de biologie moléculaire: Problèmes: Fixateur Echantillonnage Eosine Equipement spécifique Aide à la lecture On n’identifie que la cassure d’ALK

Clin Cancer Res 2010 D5F3 or D9E4 antibodies J Clin Pathol 2010 ALK 5A4 Journal of Thoracic Oncology 2011 ALK1+ système de révélation

Bilan ALK 2011 Trimestre 1 Trimestre 2 Trimestre 3 Trimestre 4 (Octobre) Nb patients 180 30 64 58 27 Nb examens 62 56 24 % Translocations 20% 6,4% 1,8% 4,2% Délai de rendu 15 jours 12 jours 11 jours % Prescriptions secteur privé 20,3% 24,1% 14,8% % Non interprétables 0% 16,1%

Mutations de K-Ras Exon 1 GGT GGC GCA CCA Exon 1 Codon 12 Glycin Codon 13 Codon 59 Codon 61 TGT Cystin CGT Arginine GTT Valine AGT Serine GAT Aspartate GCT Alanine Mutations activatrices en position 12,13 or 61 Mutuellement exclusives avec celles d’ EGFR Associées au tabac (transv. G en T ou C) 22% des ADC ( très rares ds malpighiens) Mais chez 15% des non fumeurs (transition G en A)

BRAF Marchetti et al J Clin Oncol 2011 1,046 NSCLCs BRAF mutations were present in 36 ADCs (4.9%) and one SCC (0.3%). Twenty-one of the mutations (56.8%) were V600E, and 16 (43.2%) were non-V600E. Paik et al J Clin Oncol 2011 BRAF mutations occur in 3% of patients with lung adenocarcinoma and occur more commonly in current and former smokers

BRAF mutations occur in approximately 5% of pulmonary adenocarcinomas, often with a papillary architecture, but in the micropapillary subgroup, the incidence rises to approximately 20%, similar to that seen in thyroid and ovarian papillary adenocarcinoma. Yousem et al The histopathology of BRAF-V600E-mutated lung adenocarcinoma. Am J Surg Pathol. 2008 Rosane De Oliveira et al Micropapillary Lung AdenocarcinomaEGFR, K-ras, and BRAF Mutational Profile Am J Clin Pathol 2009

Shigematsu Cancer Res 2005; HER2 mutations were present in 1.6% (11 of 671) of NSCLC Pao Lancet Oncol 2011 HER2 mutations are present in 2% of NSCLC

PIK3CA PIK3CA Mutations and Copy Number Gains in Human Lung Cancer Cancer Res 2008;68(17):6913–21] 1,6% de mutations. PIK3CA copy number gains occur at much higher frequencies in lung cancers than do activating mutations and the gains target squamous cell carcinomas. IGR Essai précoce: GDC-0941, inhibiteur de la protéine PI3 kinase

Autres biomarqueurs KRAS HRM/SEQ 201 20% 558 22,9% BRAF PCR-ASO - 316 TECHNIQUE NB TOTAL + % MUT 2010 NB TOTAL + % MUT 2011 KRAS HRM/SEQ 201 20% 558 22,9% BRAF PCR-ASO - 316 1,7% HER2 68 1,5% PI3K (ICR) SEQ 9 0%

Améliorations Techniques EGFR: Passage techniques plus rapides et sensibles, redesign des amorces, sensibilisation fixateur: moins de prélèvements non interprétables, délais raccourcis FISH ALK: criblage IHC systématique corrections éosine acidité, contrôle externalisé des cas litigieux

EXON 19 EXON 21 EXON 18 EXON 20 Mutation recherchée DELETIONS MUTATIONS PONCTUELLES MUTATIONS PONCTUELLES T790M INSERTIONS Techniques utilisées HRM/ ANALYSE DE FRAGMENT PCR-ASO HRM/ SEQUENCAGE PCRASO/

Améliorations gestion Interface cliniciens/plateforme: Mélanie Boussard Fiche modifiée téléchargeable Développements informatiques pour recueil de données et rendu résultats (fiches complémentaires)

BILAN EGFR 2011 Trimestre 1 Trimestre 2 Trimestre 3 Trimestre 4 (Octobre) Nb patients 609 168 200 173 68 Nb examens 578 186 162 62 % mutations 5,9% 9,7% 13,6% 6,45% Délai de rendu 8 jours 5 jours % Prescriptions secteur privé 44% 37,5% 35,3% 44,1% % Non interprétables 4,2% 1,6% 2,5% 0%

TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 TRIM 4 TOTAL 102 113 154 174 FUMEUR 14 58 54 64 NON FUMEUR 36 37 45 ANCIEN FUMEUR 9 17 20 18 NON RENSEIGNE 65 2 43 47 HOMME 53 96 83 FEMME 50 76 63 75 3 5 10 ANNEE 2010 TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 TRIM 4 TOTAL 162 157 174 FUMEUR 90 95 99 NON FUMEUR 38 32 34 ANCIEN FUMEUR 26 23 33 NON RENSEIGNE 8 7 HOMME 93 102 111 FEMME 68 55 58 ANNEE 2011

Evolution du tabagisme et du nombre de femme/homme (en %)

Aujourd’hui Un dossier enregistré le vendredi Résultats exon 19/21/20 IHC ALK le mercredi Résultats KRAS BRAF HER2 le vendredi Si demande PI3K transfert ICR si matériel restant

Délais Délai de rendu des résultats (en jours) TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 2010 15 11 9 2011 8 5 Délai d’acheminement de la demande entre le prescripteur et le laboratoire de biologie moléculaire (en jours) TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 TRIM 4 2010 - 11 6 2011 5 7

Augmentation du nombre de dossiers pour les différentes analyses depuis le début de l’activité

Les non conformités les plus retrouvées Fiches de prescription directement envoyée au laboratoire de biologie moléculaire sans prélèvement Le stade TNM de la maladie n’est pas indiqué ou ne correspond pas aux indications précisées pour la prescription de l’analyse Le statut tabagique n’est pas renseigné La date de prélèvement n’est pas renseignée Le fixateur n’est pas renseigné Le numéro du prélèvement inscrit sur la fiche de prescription est absent ou ne correspond pas au numéro du bloc La congélation du prélèvement n’est pas indiquée 1 dossier de prescription sur 3 n’est pas conforme… Ce qui entraine: Un retard de traitement et donc un retard de rendu des résultats Une perte de temps pour l’ingénieur qui doit rappeler les prescripteurs/anatomopathologiste Un défaut dans les statistiques rendus à l’INCA

Reste à améliorer Délai d ’acheminement Délai de réponse (protéinase K, DCC) Évolution continue des techniques Renseignements cliniques Projet IFCT de recueil des données

Le futur sur la plateforme Prescrire via le DCC ONCOMIP (Suivi, rendu des résultats) Améliorer la détection des anomalies les plus utiles (plateforme aide lecture FISH, MAD pyroséquenceur) Participer aux études nationales et aux STIC Développer l’IHC Développer la détection de nouveaux biomarqueurs (amplification c-met, FGFR…) Exploitation des données recueillies projet IFCT

Le futur ALK: algorithme IHC/FISH EGFR: place des anticorps? Marqueurs prédictifs de réponse (TS..): IHC Etudes multicentriques de validation, STIC