Céline Pellentz Marianne Simon 06/08, longévité et vieillissement Un modèle pour étudier chez la Drosophile la toxicité induite par Aβ42 de la maladie d’Alzheimer Molecular and cellular neuroscience, 2004 Finelli, A. Kelkar, HJ. Song, H. Yang, M. Konsolaki Cambridge

Phase non symptomatique La maladie d’Alzheimer: une brève présentation La maladie d’Alzheimer: une brève présentation 1906 Aloïs Alzheimer décrit des altérations anatomiques observées post-mortem sur une femme atteinte de démence, d’hallucinations et de trouble de l’orientation Présentation du sujet et Problématique Présentation du sujet et Problématique Maladie d’Alzheimer maladie neurodégénérative du système nerveux central 60 à 80% des démences chez les plus de 65ans, forme familiale dans 1% des cas Les expériences et résultats Les expériences et résultats Phase non symptomatique Durée Environ 20-30 ans Synthèse Synthèse Stade précoce Perte de la mémorisation, troubles du langage ( périphrases ) et de l’orientation spatiale et temporelle, angoisses (voire de dépression) Durée Environ 10 ans Stade symptomatique Conclusion Conclusion Stade modéré troubles de la mémoire (noms des proches, évènements récents), difficulté d’expression et de compréhension des mots, désorientation spatiale et temporelle (chez lui, mois, saison…), hallucinations et/ou des délires Stade tardif faiblesses physiques, vulnérabilité à diverses infections (souvent cause de décès), disparition de la mémoire  à long terme, expression orale limitée à quelques mots (voire mutisme total), difficultés à se mouvoir, incontinence

La maladie d’Alzheimer: mécanisme moléculaire et traitements Présentation du sujet et Problématique Plaque amyloide Dégénérescence neurofibrillaire Vaccin anti-Ab Chélateur du cuivre Diagnostic précoce (IRM,TEP) En essai clinique Les expériences et résultats Limiter les facteurs de risque Inhibiteurs de canaux NMDA cholinestérase Traitements Synthèse Conclusion Thérapie génique avec le NGF siRNA contre b-sécrétase Inhibiteurs de b ou g-sécrétase b-sheet breakers En recherche…

Les modèles de la maladie d’Alzheimer Présentation du sujet et Problématique les singes âgés : troubles cognitifs et de la mémoire, anomalies cellulaires (dépôt d'amylose, anomalie du cytosquelette des neurones) dans le cortex et l'hippocampe Les expériences et résultats Souris transgéniques pour APP, PS1 ou TAU muté plaque amyloïde, dégénérescence fibrillaire, activation des astrocytes. principal modèle MAIS conséquences comportementales difficiles à caractériser, temps et coût Synthèse C. Elegans : expression de Ab42 avec une séquence signal extracellulaire dans le muscle paralysie, plaque amyloïde Intérêt : phénotype rapide, crible génétique possible Conclusion Drosophile : possède APPL (mais pas la partie Ab), g-sécrétase mais pas b-sécrétase APP humain : problème de développement APP+b-sécrétase : production de peptide Ab et neurotoxicité Intérêts: peut regarder rapidement les phénotypes (longévité,dégénérescence de l’œil, locomotion, mémoire) + peut observer l’effet de produits létaux dans l’oeil diapo4 Problème non résolu par ces modèles : rôles respectifs de Ab40 etAb42 dans la pathologie ?

La création de souches exprimant le peptide Aβ Promoteur Site d’expression Transgène Marqueur Nom des souches GMR Œil Ab40 Gène white [yeux pigmentés] Dose dépendant L1 Ab42 K1,K3,K52,K53 Ø 1 UAS (+elavGal4) neurones H29.3 C99 I8 GFP Présentation du sujet et Problématique Embryons [yeux blancs] déchorionné stade blastoderme syncitial P A Les expériences et résultats Injection du plasmide d’intérêt avec la transposase Transposition dans le noyau d’une cellule germinale Synthèse Pour chaque individu aux yeux pigmentés (souche indépendante) Détermination du chromosome où a eu lieu l’insertion (grâce aux chromosomes balanceurs) Établissement de souche homozygote ou hétérozygote Croisements de souche Conclusion [yeux blancs] diapo5 X [yeux blancs] non transfectée Mouche transgénique

Augmentation de la dégénération parallèlement à l’accumulation de Ab Possibilité d’avoir un phénotype observable aisément? Expression dans l’œil Rouge ponceau WB Anti-Ab Témoin positif Témoin négatif (Plasmide vide pGMR) Présentation du sujet et Problématique Mouches exprimant Ab42 pGMR-Ab42K1 homozygote pGMR-Ab42K3 homozygote pGMR-Ab42K52 homozygote K52/K52 Les expériences et résultats Synthèse Conclusion diapo6 Augmentation de la dégénération parallèlement à l’accumulation de Ab

Expression d’ Aβ42 dans le cerveau 50% % de survie jours UAS-C99I8 hétérozygote + elavGal4C155 elavGal4C155 UAS-Ab42H29.3 hétérozygote UAS-Ab42H29.3 hétérozygote + elavGal4C155 Longévité en présence d’Ab42 dans le cerveau Longévité des témoins Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion diapo7 L’expression de Ab42 dans le cerveau diminue la longévité des Drosophiles

Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine Aβ42 s’agrège à l’extérieur des cellules Présentation du sujet et Problématique extraits protéiques de tête de mouches GMR-Aβ42K3 – Western Blot Les expériences et résultats La majorité des peptides Aβ42 présents dans la tête des Drosophiles est sous forme insoluble Synthèse ponceau Conclusion Test Elisa de la présence d’Aβ dans le surnageant de cellules de Drosophiles transfectées par UAS-Aβ40. Pept extrait de tête a sa seq d’adressage clivée Le peptide Aβ40 - et donc sans doute Aβ42 (même séquence signal) - est sécrété par les cellules l’exprimant

Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine La sévérité du phénotype est fonction de la dose d’Aβ42 agrégé Présentation du sujet et Problématique immunomarquage du peptide Aβ42 sur des cryosections horizontales d’œil de Drosophile adultes (4-5 jours). corrélation quantité de peptide / degré de désorganisation? Les expériences et résultats Bleu de toluidine Synthèse wt Aβ42K10 témoin Aβ42K3 homozyg Aβ42K10 homozyg Conclusion L’intensité du phénotype croit avec la quantité de peptide accumulé

Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine La sévérité du phénotype augmente avec l’âge Présentation du sujet et Problématique  Mouches GMR-Aβ42K3 hétérozygotes. Comptage du nombre de mouches dans chaque catégorie phénotypique au cours de l’âge. Shift wt/mild -> mild/moderate Plus d’évolution après le 32ème jour Les expériences et résultats Synthèse La sévérité du phénotype croit avec l’âge, jusqu’au 32ème jour. Conclusion Mild: ommatidies sombres, éparses, sur la face ventrale de l’œil Moderate: ommatidies plus désorganisées  Augmentation sévérité due augmentation sensibilité à même q Abéta? Plus d’accu d’Abéta?  Western Blot d’extraits protéiques de têtes de Drosophiles GMR-Aβ42K3 à 0-2 ou 35 jours. L’augmentation de la sévérité du phénotype avec l’âge doit être due à une accumulation croissante d’Aβ Ponceau

Recherche de gènes modulateurs du phénotype sur ce modèle Sélection d’un mutant surexprimant la néprisiline Présentation du sujet et Problématique Démarche du crible Nature de la souche sélectionnée 2000 souches EP d’une banque publique (expression des insertions EP dans les cellules où Aβ est exprimé grâce à eyGal4) Souches GMR-Aβ42 Insert EP inséré en amont du Drosophila neprilysin 2 gene => upregulation de sa transcription Les expériences et résultats Synthèse 23 souches ayant un effet modificateur et n’entrainant aucun phénotype au niveau de l’œil en absence d’Aβ Conclusion Dont un suppresseur du phénotype le plus sévère Nature de cette souche et étude plus précise de son effet sur le phénotype d’Aβ42 L’insertion EP entraine une multiplication par 5-6 de l’activité de nep2

Recherche de gènes modulateurs du phénotype sur ce modèle Effet de la surexpression de nep2 sur l’accumulation du peptide Aβ42 Présentation du sujet et Problématique Nep2 code une protéase Western Blot d’extraits protéiques de têtes de Drosophiles GMR-Aβ42K3 hétérozygotes ou GMR-Aβ42K3 hétérozygotes ; EP(3)3549nep2 Les expériences et résultats La surexpression de nep2 entraine une diminution de l’accumulation de peptide Aβ42 Ponceau Synthèse Effet de la surrexpression de nep2 sur le phénotype durée de vie Conclusion  Coexpression dans le SNC induite par Gal4 de Aβ42H29.3 et de nep2 IDE = Insulin Degrading Enzyme : active dans cytoplasme, dégrade Abéta soluble mais pas agrégé => confirmation Abéta 2 aggrégé Pt être atténuation phéno par compet des différentes UAS -> UAS-GFP : effet existe mais n’explique pas tout 50% témoin La surexpression de nep2 atténue le phénotype « raccourcissement de la durée de vie »

Bilan: La Drosophile, un bon modèle… Aβ sous forme d’oligomères insolubles et de plaques extracellulaires Aβ42 semble être sécrété et être retrouvé sous forme insoluble Oligomères responsables de la neurotoxicité Phénotype croissant avec la quantité d’Aβ accumulé Symptômes à évolution progressive  La sévérité du phénotype s’accroit avec l’âge. Présentation du sujet et Problématique Un modèle plutôt fidèle à la pathologie humaine, au moins au niveau moléculaire. Les expériences et résultats Synthèse Toxicité d’Aβ pour les photorecepteurs => phénotype très marqué dans l’œil Toxicité pour les neurones du SNC mesurable par la diminution de la durée de vie Permettant une caractérisation phénotypique aisée Conclusion Sur lequel on peut mettre en œuvre des outils efficaces Crible de gènes modulateurs, ici par banque gain de fonction Identification d’un gène connu en modèle Souris Relation entre agrégation d’Aβ et toxicité? Cible cellulaire de la toxicité d’Aβ? Réponse cellulaire à Aβ? Pourquoi la pathologie AD est elle âge-dépendante? Quel est le mécanisme de la toxicité médiée par tau? D’où de possibles réponses aux questions que l’on peut poser à un tel modèle Link, 2005

Un modèle qui ne pourra pas tout expliquer … Mais avec ses limites Présentation du sujet et Problématique Maladie d’Alzheimer = maladie complexe, origines variées  Ne modélise que la cascade amyloïde (implication de tau) Un modèle qui ne pourra pas tout expliquer Les expériences et résultats Homologue Appl d’APP n’a pas de domaine Aβ-like. Pas d’activité β-sécrétase.  Présence des intervenants du mécanisme moléculaire chez l’homme? Aβ40 présent dans les plaques amyloïdes  Instable dans le modèle, même en présence de peptide Aβ42. Synthèse Des différences au niveau moléculaire même qui peuvent mettre en doute les conclusions Conclusion Bon modèle pour les premières études des mécanismes moléculaires (cribles impossibles chez un mammifère) Mais tous les résultats sont à vérifier en modèle Mammifère = garder en mémoire que ce n’est qu’un modèle

Analyse critique Présentation du sujet et Problématique Des méthodes expliquées un peu succinctement (Ponceau), comme la caractérisation des souches. Des changements de souche étudiée rendant parfois l’interprétation un peu « hasardeuse » Ex: étude de la sévérité des phénotypes en fonction de la quantité de peptide accumulé, Immunomarquage d’Aβ sur des coupes d’yeux homozygotes pour Aβ42K3 ou Aβ42K10 observation de l’organisation des ommatidies dans des souches Aβ42K3 hétérozygotes et homozygotes ou Aβ42K52 hétérozygotes. Étude de la sécrétion du peptide Aβ40 au lieu du peptide Aβ42. -> Même séquence signal mais comportement très différent -> Aβ42 a une séquence signal clivée dans la mouche mais chez le C. elegans Aβ s’accumule DANS les cellules bien que sa séquence signal soit clivée (Link 1995) Les expériences et résultats Synthèse Conclusion

Utilisations ultérieures du modèle Présentation du sujet et Problématique Ce modèle a été utilisé pour des tests : De mémoire (olfaction) De locomotion De survie Les expériences et résultats L’accumulation de Ab40 ou Ab42 peut altérer la mémorisation MAIS seule Ab42 est capable de faire des plaques amyloïdes, de provoquer la dégénérescence des neurones, de causer des problèmes locomoteurs et enfin une mort prématuré. (Liima and al. 2004) Synthèse Conclusion Perspectives diapo16 Ce modèle de Drosophile peut servir de crible pour trouver des pistes thérapeutiques ciblant les plaques amyloïdes et leurs conséquences.

BONUS

Le modèle UAS-Gal4

hypothèse de la cascade amyloïde