CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE CHAPITRE V CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE OU CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)

I – INTRODUCTION ♠ Est une technique complémentaire de la CLHP ; ♠ Mise en oeuvre de ces deux techniques soit ≠, la séparation et la nature de phases restent les mêmes ; ♠ Analyse quantitative (reproductibilité des dépôts et la nature des concentrations), (densimètres automatiques) Mise en oeuvre de la chromatographie planaire. ♠ On utilise des plaques (verre, plastique, ou Aluminium, recouverte d’une fine couche (100 – 200 µm) de phase stationnaire (gel de silice modifié ou non) ; ♠ Les mélanges à séparer est déposer sur la couche adsorbante. Le chromatogramme est développé dans une cuve contenant le solvant d’élution ;

♠ Le choix des solvants d’élution est guidé par les caractéristiques des substances à séparer. On considère que les substances sont hydrophiles (soluble dans l’eau) ou hydrophobes (insoluble dans l’eau), puis on contrôle leurs propriétés acides, basiques, ou neutres et enfin la possibilité de réactions chimiques avec le solvant d’élution aussi bien qu’avec l’adsorbant. Sur la base de ces considérations, on a développé deux types de phase stationnaire : ▲ Pour les substances hydrophobes : oxyde d’aluminium, gel de silice, cellulose acétylée, polyamide. ▲ Pour les substances hydrophiles : celluloses, kieselgular (terre de diatomée), polyamide.

Les avantages propres à la chromatographie planaire : ♦ Temps de développement courts (2 à 60 min) ♦ Distances de séparation petites ; ♦ Très bonne résolution ; ♦ Très haute sensibilité ; ♦ Très petites quantités d’échantillon utilisées. ◙ Chaque composé est défini par Rf (abréviation " retardation factor") qui correspond à sa migration relative par rapport au solvant : Distance parcourue par le soluté X Rf = = Distance parcourue par le front de solvant X0

◘ On définit l’efficacité N de la plaque pour un composé dont la distance de migration est X et le diamètre de spot w par la relation. N = 16 et H = w2 N X2 X ◘ Pour calculer le facteur de rétention K d’un composé où la sélectivité entre deux composés. On pourra relier Rf et K : Rf = = = = X0 ù0 t K + 1 X ù t0 1 1 K = - 1 Rf

◙ On admettra que la résolution a pour valeur W1 + W2 X2 – X1 Révélation post – Chromatographique ► Pour les composés incolores, ils doivent être révélés ; ► Pour faciliter la localisation des taches, il existe des plaques contenant (sel de Zine) fluorescent ajouté à la phase stationnaire ; ► En éclaire la plaque avec une lampe à vapeur de mercure (lumière de Wood), on voit apparaître des taches sombres aux endroits où se trouvent les composés qui absorbent la radiation excitatrice ; ► Une méthode quasi universelle, la plaque est soumise à un " pluverisation" d’acides sulfuriques, ensuite en carbonise les composés en chauffant la plaque.

Paramètres de séparation et de rétention Plaque de CCM Vapeur de l’éluant Eluant X1 X0 CCM quantitative : Pour rendre la CCM quantitative, il faut pouvoir quantifier les taches. Dans ce but , la plaque à examiner est déplacée sous l’optique d’un densitomètre (ou scanner) qui mesure soit l’absorption, soit la fluorescence à une ou plusieurs longueurs d’ondes. Cet appareil conduit à un pseudo chromatogramme comportant des pics dont on mesure les aires.

Front 100 - 80 - absorbance 60 - Start 40- 20 - unités arbitraires

CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION La chromatographie d’exclusion ou de perméation de gel est fondée sur les rétentions sélectives des molécules de soluté en fonction de leur taille en raison de leur pénétration dans les pores, remplies de solvants, d’une phase stationnaire appropriée. Les grosses molécules exclues de la totalité ou d’une partie seulement des pores de la phase stationnaire, migrent plus rapidement que les petites molécules qui peuvent pénétrer dans un plus grand nombre de pores. La séparation est donc basée sur la totalité des molécules en solution

Le détecteur utilisé dans cette technique est presque exclusivement le réfractomètre différentiel. Le volume de rétention VR des molécules x est donné par l’équation : VR = Vi + kVp Vi : volume interstitiel de la colonne ; Vp : volume des pores de la phase stationnaire ; K : coefficient de distribution des molécules x.

Il y a deux cas limites : ♣ K = 0 : les molécules considérées sont totalement exclues, en raison de leur taille, des pores de la phase stationnaire et l’on a : VR = Vi Toutes les molécules sortent en même temps de la colonne après le passage d’un volume de solvant égal au volume interstitiel de la colonne. ♣ K = 1 : Tous les pores de la phase fixe sont accessibles aux molécules considérées et l’on a : VR = Vi + kVp = VT VT est appelé volume de perméation totale.

En chromatographie d’exclusion, on a l’habitude de porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume de rétention. La courbe obtenue présente généralement une partie linéaire. A chaque valeur du volume de rétention correspond une masse moléculaire. Vi Vp VR VT K = 0 Exclusion Perméation sélective Perméation totale K = 1 107 - 106 - 105 - 104 - 103 -