La détection des mutations: pourquoi? fins diagnostics: - validation du diagnostic chez individu symptomatique - Pathologie héréditaire (maladie génétique) ou somatique (cancer) Déterminer si un gène candidat est responsable de la pathologie Etudier les relations structure/fonction du gène NB: Diagnostic génotypique pas forcément nécessaire: - En France, dépistage néonatal systématique de 3 maladies génétiques (phénylcétonurie, mucoviscidose, et drépanocytose) par des approches biochimiques

 Un seul gène ou plusieurs gènes La détection des mutations: comment? Deux situations différentes: Mutations inconnues:Balayage (scanning) Mutations connues: criblages (screening)  Un seul gène ou plusieurs gènes -Mutation unique (très rare) -Mutations prédominantes par effet fondateur -Points chauds de mutations -Spectre bien défini avec fréquences allèliques dans la population Un gène ou plusieurs gènes candidats recherche sur la totalité du gène

Maladie Gène Mutation Remarque Drépanocytose HBB Un seul codon (6), un seul faux-sens (Glu->Val), une seule mutation (GAG ->GTG) Monoallélisme stricte Achondroplasie FGFR3 Un seul codon (380), un seul faux-sens (Gly->Arg), deux mutations nt1138 (G->A; G->C) Monoallélisme par récurrence en un point chaud Mucoviscidose CFTR Del508 >1300 autres 66% des allèles 30% des allèles Myopathie de Duchenne DMD Délétion de 1 ou plusieurs exons Duplication de 1 ou plusieurs exons Mutation ponctuelle variable 65% des allèles 10% des allèles 25% des allèles Neurofibromatose de type 1 NF1 >250 mutations différentes (74% petites mutations) Taux de néomutations élevé (10-4)

La détection des mutations: comment? (suite) Les autres facteurs influençant la stratégie: - La nature attendue des mutations - La taille et la structure du locus exploré - Le matériel disponible (ADN, ARNm) - Le degré de sensibilité nécessaire

La détection des macromutations Grandes délétions, insertions, duplications, inversions et translocations plusieurs centaines de pb voir des milliers ADN - 1) Cytogénétique classique et cytogénétique moléculaire -2) Southern blot -3) PCR fluorescente ARN -4) RT-PCR

1) Cytogénétique moléculaire FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Principe: l’ADN est visualisé grâce à une sonde qui est soit un haptène ( ex: digoxigénine) révélé par un anticorps fluorescent ou directement par un fluorochrome Cibles: uniques de l’ordre de quelques Kb mais aussi des cosmides, YAC. Applications du FISH: - cartographie des marqueurs (Bac ou Yac) sur des chromosomes métaphasiques (l’une des phases de la mitose) et en particulier les bac chimères - identification des chromosomes en particulier dans les hybrides somatiques surtout après irradiation qui fragmente les chromosomes - identification de petits fragments chromosomiques remaniés - hybridation in situ en interphase permettant d’identifier sur de la chromatine des séquences distantes de 100kB seulement ainsi que des chromosomes remaniés

FISH ciblée FISH locus spécifique Sonde spécifique de gènes ou loci Peinture chromosomique Sonde de peinture d’un chromosome entier Ex: Détection t(9;22) dans les LMC Ex: t(8;21) dans une LMA

Méthodes de FISH global M-FISH (multi-FISH) SKY (Spectral karyotyping) 24 sondes de peinture chromosomiques spécifique des 22 autosomes et X/Y. Utilisation d’un mélange de sondes dont la composition est spécifique d’un chromosome donné. CGH Comparative Genome Hybridization) -ADN génomique testé et ADN génomique témoin Méthode permettant de quantifier et de localiser des microremaniements d’ADN - La résolution est maximale car elle ne dépend que de l’objet à analyser - Très utilisée pour les remaniements dans les cancers - Shéma expérimental (diapo suivante) Ex: translocation (7p;12q) (Dupont JM, Cochin)

La méthode de CGH CGH sur chromosomes CGH sur microarray Résolution 5-10Mb Numérisation du signal -> lecture quantitative CGH sur microarray Résolution dépend du matériel génomique utilisé. Permet de descendre à l’échelle de l’exon

2) Le Southern blot -Permet de visualiser une portion du génome par hybridation d’une sonde marquée sur des fragments de restriction d’ADN séparés par électrophorèse. Modifications de la carte de restriction si macromodification -Limite supérieure de résolution: ≈ 20 kb. -Pour l’analyse de plus grand fragment d’ADN génomique, electrophorèse en champs pulsés résolution max 1Mb) Inconvénients: Difficultés de détection des anomalies quantitatives hétérozygotes: saturation du signal lors de la détection

Analyse de l’ADN 3. Les dérivées de la PCR La PCR multiplex =Amplification au cours d’une même PCR de plusieurs régions différentes Mise au point assez complexe -taille de chaque amplicon différente -oligonucléotides de Tm proches ATG TAA TAG TGA AATAAA Amplicon 1 Amplicon 2 Amplicon 3 Amplicon 4

3) La PCR fluorescente -Amorce ou dNTP marqués par un fluorochome et analyse du produit d’amplification sur un séquenceur -Optimisation 1: PCR multiplex (amplification de plusieurs régions différentes) -Optimisation 2: PCR semi-quantitative (faible nombre de cycles et analyse quantitative de la fluorescence) Pertes ou gains d’amplicons entiers visualisés par absence de l’amplicon ou variation d’intensité (si hétérozygotie)

4) La RT-PCR Permet de détecter: -Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin -Transcrit ampliflié en un seul ADNc ou plusieurs fragments chevauchants Permet de détecter: - Perte ou gain de matériel visualisé par une anomalie de longueur de l’amplicon - des ARNm chimères avec des amorces spécifiques

Analyse de l’ARN 1. La RT-PCR -Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin -Transcrit amplifié en un seul cDNA ou plusieurs fragments chevauchants Permet de balayer la totalité de la séquence codante en un petit nombre de fragments chevauchants OMGP EVI2A ADNc NF1 250 bp Exons EVI2B 27b 49 2 28 17 6 8 4 7 13 19a 23-1 31 36 43 1 3 5 9 Exemple de l’amplification de l’ADNc NF1 en 9 fragments chevauchants couvrant les 9000pb de séquence condante

Cas particulier: Les amplifications de triplets Catégorie de maladies dues à des amplifications de triplets CAG, GCG,CTG - dans un exon codant: CAG (maladie de Huntington) - dans la région 3’UTR: CTG (maladie de Steinert) - dans la région promotice: CGG (Syndrome du x fragile) - dans un intron: FAA (maladie de Freidrich) Analyse par Southern blot Analyse génotypique par PCR -Problèmes méthodologiques si expansion trop importante

 Detection des Substitutions Inconnues (Scanning) -Clivage spécifique (chimique, enzymatique) -SSCP (Single strand Conformational Polymorphism) -DGGE (Denaturing gradient Gel Electrophoresis) -PTT (Protein Truncation Test): détection spécifique des codons STOP + séquençage Connues (Screening) -Southern ou PCR-hydrolyse pour mutations modifiant un site de restriction -Séquençage -PCR-ASO (Allele Specific Oligoprobe) -PCR-OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) -PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System) -PCR suivie d’hybridation sur puces

Méthode SSCP Principe: Mise en évidence La perturbation de séquence induit un changement de conformation du DNA simple brin Mise en évidence électrophorèse en gel d’acrylamide non dénaturant -Sensiblité: 60-80% de mutations détectées Conformation des brins

Méthode DGGE (Denaturated Gradient Gel Electrophoresis) - La perturbation de séquence induit un modification de la température de fusion -Mis en évidence par electrophorèse en gel d’acrylamide en gradient dénaturant -Choix des amplicons doit tenir compte des domaines de fusion de la séquence -Amplicons de 100-300 pb -Bonne sensiblité

Le Protein Truncation Test (PTT) -Mise en évidence d’une protéine tronquée due à la présence d’un codon STOP prématuré -Promoteur T7 ajouté à l’amorce 5’ Système de transcription/traduction in vitro Analyse des polypeptides sur SDS-PAGE

Méthode de PCR-ASO - Mésappariements dans un court fragment diminuent la température de fusion de l’ hybride - Synthèse de 2 oligosondes: Séquence normale Séquence mutée - Hybridation avec produit PCR de la région à étudier: conditions ne permettant que les appariements parfaits - Visualisation par dot-blot Nécessité d’étudier des témoins en parallèle

Techniques basées sur une extension différentielle d’amorce Miniséquençage: Allèle normal Allèle muté T A C G Extension d’amorce (Taq Pol) + F1-ddTTP +F2-ddCTP Elimination des ddNTP et analyse du produit d’extension + ddNTP Miniséquençage: analyse de fluorescence sur séquenceur d’ADN MALDI-TOF: analyse de masse moléculaire de l’oligo MALDI-TOF: