Évaluation de la toxicité d’un polluant But : estimer les relations entre l’exposition d’un organisme à un polluant et sa réponse Tests de toxicité aiguë : ils ont lieu sur une courte période comparativement au cycle de vie des organismes. Ce terme est utilisé pour définir soit l’exposition, soit la réponse à cette exposition. Un effet toxique aiguë est induit et observé sur une courte période d ’exposition Tests de toxicité chronique : ils sont réalisés pendant des expositions plus longues (10 à 20 % du cycle de vie). Les effets constatés lors d’une telle exposition sont qualifiés de chroniques. Ces effets sont à relier à des changements de métabolisme, de la reproduction, de la croissance ou de l’aptitude à survivre. Les concentrations d’expositions sont plus faibles que ceux des test de toxicité aiguë. Les tests de génotoxicités : ils permettent de détecter la capacité d’une substance ou d ’un processus physique à générer des dommages sur le matériel génétique.

Courbe théorique dose réponse : 0.1 Réponse (%) * 100 * * 50 * LOEC CE50 : dose qui affecte 50% de la population NOEC : concentration sans effet observés LOEC : plus basse concentration efficace NOEC Témoin * 1 CE50 10 100 Concentration en polluant

Les tests biologiques ou bioessais Procédures effectuées en laboratoire et destinées à déterminer, à l’aide d’expérimentations sur divers types d’êtres vivants, les activités biocides et/ou les particularités toxicologiques de substances chimiques Critères d’homologation des bioessais : simplicité rapidité d’exécution reproductibilité sensibilité représentativité des conditions naturelles coût économique le plus faible possible

Catégories de tests biologiques Trois catégories principales de biotests - tests de létalité - tests sublétaux - tests à long terme - tests de reproduction - tests d’effets mutagènes - tests d’effets tératogènes - tests d’inhibition de croissance

Les tests létaux Détermination des CL 50 dans des expositions à court terme (24-96 h) sur des organismes de référence (rotifères, daphnies, truitelles) Exemple de bioessais létaux en milieu aquatique • test daphnie (Daphnia magna), normalisé en France par l’AFNOR (NF T90 301) • test truitelle (Oncorhynchus mykiss) (NF T90 305) • test poisson zèbre (Brachydanio rerio) (NF T90 303) • test bar (Dicentrarchus labrax) (NF T90 307) Exemple de bioessais létaux en milieu terrestre • tests lombriciens : Eisenia foetida (ISO 11268-1; OCDE 207) • tests insectes pour toxicité atmosphérique

Fidélité : bichromate de potassium (+) Répétitivité (même personne) Seuil d’effet : 10% Fidélité : bichromate de potassium (+) Répétitivité (même personne) Reproductibilité (labo différents) Prélèvement Conservation

Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (1) en milieu aquatique : • test de croissance d’algues unicellulaires (NF T90-375) exposées à un polluant toxique à une dilution inférieure à celle provoquant la mortalité aiguë - numération au compteur ou spectrophotométrie Espèces cibles : Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum • test d’inhibition d’activité biologique : inhibition de la bioluminescence bactérienne (sous produit de la respiration cellulaire) sur Vibrio Fischeri (Test MICROTOX) • test d’inhibition de la photosynthèse

Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (2) en milieu terrestre : tests macroinvertébrés de la pédofaune pour toxicité des sols ou de l’air • isopodes (cloportes) Porcellio scaber et Oniscus asellus • acarien de litière des forêts Platynothrus peltifer (métaux toxiques) • collembole Folsomia candida (test normalisé à 28 jours) OCDE • acariens corticoles pour biotests d’aéropolluants • mollusques gastéropodes pulmonés (limaces, Arion ater) et escargots (Helix adserpa, H. pomatia) biotests d’effets sur la reproduction • plantes

LE TEST DE GERMINATION En l'absence de norme concernant spécifiquement les sous-produits organiques, ce test est inspiré de la norme NF X 31-201 concernant les substances chimiques solubles dans l'eau. La méthodologie du test est celle définie par la norme avec les modifications inhérentes aux produits testés (boues de STEP, composts, ...), pour trois doses. Objectif : Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la germination des semences mises en contact avec différentes concentrations du produit testé. Méthodologie : Substrat : sol standard, ou sol du site d'épandage du produit étudié.  Plante test : orge, cresson (NF X 44-167), ou plante cultivée sur le sol recevant le produit. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées : 3 multiples de la dose d'épandage maximale, déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test : 4 à 7 jours. Paramètres mesurés : taux de germination.

LE TEST DE CROISSANCE FOLIAIRE Objectif : Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la croissance des parties aériennes des végétaux supérieurs mis en contact avec différentes concentrations du produit testé. Méthodologie : Substrat : sol standard, ou Sol du site d'épandage du produit étudié. Plante test : orge, cresson, ou plante cultivée sur le sol recevant le produit. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées : 3 multiples de la dose d'épandage maximale, déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test :17 jours. Paramètres mesurés: matière fraîche et matière sèche des parties aériennes de la plante.

LE TEST DE CROISSANCE RADICULAIRE Objectif : Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la croissance radiculaire des végétaux supérieurs mis en contact avec différentes concentrations du produit testé. Méthodologie : Substrat : sol standard, ou sol du site d'épandage du produit étudié. Plante test : orge. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées: 3 multiples de la dose d'épandage maximale déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test : 17 jours. Paramètres mesurés : longueur de la plus longue racine et matière sèche radiculaire.                                                                                                                                                                                                                                     

Place des effets génotoxiques parmi les différentes toxicités « Les toxicités » Echelle de temps Court terme Moyen terme Long et Très long terme Toxicité aiguë Toxicité chronique Toxicité génétique RISQUE VISIBLE RISQUE CACHE Critères de mesure Mortalité Croissance Reproduction Altérations du patrimoine génétique MUTAGENESE TERATOGENESE CANCEROGENESE

La mesure des effets génotoxiques Des systèmes d’alarme à court terme Des systèmes sensibles (doses sublétales) La mutation comme événement de base pour mesurer les effets Lésions Pré-mutationnelles Mutations ponctuelles chromosomiques

Tests de génotoxicités : Essais à court terme utilisés pour évaluer la génotoxicité de différents composés chimiques, d’effluents ou de déchets toxiques Bioindicateurs d’effets : micronoyaux Test Trad FETAX COMET assay Test de mutation génique

Tail moment = d x IF (Intensité de fluorescence dans la queue) Le test COMET S’effectue sur tout type de cellules Visualisation des cassures de l’ADN Méthode quantitative IF d Tail moment = d x IF (Intensité de fluorescence dans la queue)

16 14 12 Plomb 10 Tail moment Témoin 8 6 4 2 2 4 7 12 24 Temps (h)

Test nécessitant des cellules en mitoses 1- Les micro-noyaux Larves d’amphibiens : globules rouges (NF T90 327) Poissons : globules rouges Lymphocytes et érythrocytes de souris Racines de Vicia faba (NF T90 327) Deux effets : Cassures de l ’ADN Poisons mitotiques Test nécessitant des cellules en mitoses

Test MN Vicia faba AFNOR NF T90-327 Lixiviat ISO/PRF TS 21268-2 Les graines sont hydratées pendant 24 heures à température ambiante dans de l’eau déminéralisée, puis sont écossées. Les graines sont désinfectées au moyen d’hypochlorite de calcium (CaClO 0,9%, 15 minutes) puis rincées à l’eau déminéralisée avant d’être mises à germer verticalement, à 24°C Après 3 jours, les extrémités des racines sont coupées (5 mm environ) de façon à favoriser le développement des racines secondaires. Les graines sont alors placées au dessus d’un récipient contenant le milieu nutritif préalablement oxygéné (solution de Hoagland), à 22°C. Après 5 jours, les racines secondaires peuvent être utilisées pour le test. Pour l’exposition, cinq plantules sont placées dans un récipient contenant la solution d’exposition, les racines étant immergées. Cinq répétitions sont mises en place pour chaque concentration. Les récipients sont placés à l’obscurité et à 24 °C pendant 30 heures. Deux contrôles sont mis en place (positif et négatif) En fin d’exposition, les extrémités des racines (environ 2 cm) d’une douzaine de racines secondaires sont coupées et placées une nuit à 4°C dans une solution de Carnoy. Pour l’observation, les racines sont hydrolysées dans l’acide chlorhydrique (HCl 1 N) pendant 6 minutes à 60°C. L’ADN des racines est coloré à l’orcéine pendant 3 minutes à 60°C. Six racines différentes sont observées pour chaque plantule.

x400

Évaluation des effets toxiques et génotoxiques de lisiers de porcs sur la base de 50 ans d’épandage Micronoyaux Cu (ppm) Brut Méthanisé 1 0,16 0,17 10 1,66 1,72 50 10,08 8,64 100 16,58 17,28 Zn (ppm) Brut Méthanisé 1 0,50 0,41 10 5,12 4,12 50 31,09 20,62 100 51,17 41,28 24 Conc % 20 16 Micronoyaux 12 8 4 Conc % 1 10 50 100 Mitoses 14,0% Conc % 12,0% 10,0% 8,0% Mitose 6,0% 4,0% 2,0% 0,0% Conc % 1 10 50 100 Méthanisé Brut

Induction de micronoyaux en fonction du cuivre et du zinc total dans les solutions

ms TOT Témoin 4,55 Lisier brut 2,62 Lisier méth 4,10

Développement d’un test MN en sol contaminé par des HAP Développement d’1 méthode en sol

Résultats – Méthode normalisée et micro-culture -> Méthode normalisée (expo 24 heures en hydroponie) -> pas d’effet des sol contaminée en HAP

Résultats – Méthodes en sol -> Détermination de la durée d’exposition Toxicité et hétérogénéité des résultats après 5 jours => Résultats à 2 jours

Table 2 : Chemical analysis of soils and aqueous extracts from soils collected on industrial sites A and B

Résultats – Méthodes en sol -> Effet dose (2 jours d’exposition) Génotoxicité du sol Sensibilité de l’outil (réponse différente de l’hydroponie et lien dose-réponse)

Tradescantia paludosa Test trad

Pink mutation

Sample of 1 mutation event (photo at left) and the standard mutation scoring sheet (table on the right)

Inflorescences : période optimale d’exposition des plantes aux polluants

Chambre à gaz équipé de systèmes de contrôles Plantes exposé en milieu urbain

In situ water pollution monitoring device Aquatoon, a floating device

Utilisation du modèle amphibien Cycle de vie principalement inféodé au milieu aquatique (jeunes stades de développement = les plus sensibles) Œufs sans coquilles, puis têtards munis de branchies Larves à la peau très fine Animaux sédentaires, évolution des conditions locales AMPHIBIENS = Très bons indicateurs de la santé des écosystèmes aquatiques Grande quantité d’ADN répartie dans un petit nombre de chromosomes Cycle de développement d’un amphibien urodèle Cellules Érythrocytaires de grande taille et très bons modèles d’étude cytogénétique

cellules micronucléées L’essai des micronoyaux sur les larves d’amphibiens Une méthode standardisée au niveau National et International Normalisation AFNOR T 90-325 (2000) Normalisation internationale ISO 21427-1 (2006) 3 espèces concernées : 2 urodèles Axolotl et Pleurodèle, 1 anoure Xénope Pleurodeles waltl Xenopus laevis Ambystoma mexicanum Protocole simplifié des essais 2-Exposition des organismes (12 j) 4-Lecture/analyse des résultats 1-Production des larves - Essai préliminaire de toxicité - Essai définitif de génotoxicité Taux pour mille de cellules micronucléées Micronoyaux -Fécondation in vivo ou in vitro (HGC) -Elevage des embryons et des larves Jusqu’au stade d’utilisation dans l’essai Renouvellement quotidien des solutions d’essai 3-Prélèvements sanguins

3- test FETAX (Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus) But : déterminer les malformations, la mortalité et l’inhibition de croissance des embryons soumis aux xénobiotiques (Dumont 1983, USA) Test utilisé pour l’essai de substance seule ou en mélange - Solvants industriels - pesticides - eaux de surfaces et nappes phréatiques - extraits de sédiments - effluents de procédés de traitement des eaux Le test débute après la segmentation (stade blastula-début gastrula) : stade 8 xénope Le test fini après l’organogenèse : stade 47 (5J)

Modalités du protocole : test in vitro Femelles reçoivent 450 UI gonadotrophine (veille de l’expérience) Ponte répartition des œufs Mâles sont endormis (tricaïne méthane sulfonate) Prélèvement des testicules conservation en solution de Barth Inhibition de la mobilité des spermatozoïdes Mélange + solution FETAX restaure la mobilité des spermatozoïdes et la fertilité des œufs (8h à 22°C) Fin du stade blastula (début du test, 5j à 23°C)

Séléction des œufs (8x2/traitement) Dénombrement des larves vivantes (battements cardiaques) Anesthésie Observation des larves - mesure de la taille des larves vivantes et non mal formés - analyse des malformations Mesure de la concentration létale (CL50) à 120h Mesure de la concentration tératogène (CT50) à 120h Indice de Tératogénicité = CL50 TC50 IT<1.3 non tératogène 1.3 < IT < 2 faiblement tératogène 2 < IT < 3 modérément tératogène IT>3 hautement tératogène

- Mutations géniques : Nicotina tabacum Nicotiana sylvestrus (2n =24) Nicotiana tabacum Caractère (necrotic character) gène N Nicotiana tomentosiformus (2n =24) Le gène N (homozygote) confère l’hypersensibilité au VMT Nicotiana glutinosa (résistante à tous les virus par nécrose) Nicotiana glutinosa X Nicotiana tabacum F1 (N/n) F1 X F1 N/N (caractéristiques du tabac, Nicotiana tabacum xanthi n.c) Traitement des graines par Éthyle méthane sulfonate : Plan M1 de N. tabacum avec secteurs sur feuilles vert/jaune (J1)

Pour comprendre les variations de caractère : régénération de plantes entières à partir du fragment de limbes présentant des variations somatiques Cultures primaires Néo-formation de bourgeons Néo-formation de racines Existence d’une relation entre le phénotype V/J et la structure hétérozygote de deux gènes non liés : a1 et a2 . a1+/ a1 et a2 +/ a2 déficience chlorophyllienne partielle Décoloration = blocage de la synthèse de lamelles thylacoïdiennes Étude de la descendance coopération fonctionnelle entre a1+ et a2+ Plante néo-formée (étude la descendance)

a1+/ a1 a2+/ a2 a2+ a2+ a2+ a2 a2 a2 V1 V2 V3 Coopération fonctionnelle entre a1et a2 a1 + a1+ 1439 1218 1180 a1est fonctionnel et antagoniste de a1+ et a2+ Génotype a1+/ a1 a2/ a2, greffé sur le type vert V J1 J3 a1+ a1 815 214 14 a2 est amorphe J2 J4 a a1 a1 82 6 0 µg chlorophylle / g PF Agents mutagènes réversion ou mutation du gène a1 rétablissement de la synthèse chlorophyllienne

Conclusion Un grand nombre de tests peuvent permettre d’évaluer a priori l’action de molécules : Toxicité aiguë, Génotoxicité, métabolisme, Tératogénicité, perturbateurs endocriniens… Ces test ne peuvent entièrement prévoir les risques à long terme pour l’environnement - différentes interactions possibles entre polluant et milieu - difficile de prévoir la réaction d’une espèce animale particulière dont dépend une chaîne trophique Synergie ou antagonisme entre différentes molécules Nécessité de recherche a posteriori afin de suivre l’évolution de la qualité du milieu et son impact sur le vivant en utilisant différents bio-marqueurs Marqueurs de « stress » in situ à différent niveau d’organisation du vivant Couplage avec des analyses chimiques