Introduction à la Virologie : Pourquoi travailler sur les virus ? Qu’est ce qu’un virus ? Interactions virus/hôte: (illustration a partir d’un exemple : le virus HIV) Comment le virus se réplique ? Mécanismes de défense de l’hôte et échappement du HIV au contrôle par l’hôte. Comment peut on mettre en place des stratégies antivirales efficaces ? Etienne DECROLY AFMB/MARSEILLE

Principales causes de mortalité dans le monde

> 9 virus ont « bougé » en 10 ans 1994- West-Nile virus: N Africa, Roumania, then USA (1999) 1997- H5N1: Honk-Kong, Viet-Nam NEW 1997- Nipah virus: Malaysia 2000- Rift-Valley fever virus: crossed the Red sea… 2003- SARS coronavirus 2003- Monkeypox: USA 2005- Marburg virus (Ebola): Angola 2005- Japanese encephalitis: India 2005- Chikungunya virus: La Réunion, Indian ocean

Définition des virus Travail individuel : en 5 minutes tenter de définir la notion de virus identifier les étapes putativement ciblées par des antiviraux Travail collectif : Définir la notion de virus

Définition des virus Des objets biologiques, particulaires, de structure organisée. Infectieux, subcellulaires, doués de continuité génétique. Constitués au minimum d’un acide nucléique (ARN ou ADN) et de protéines. (soit l’ARN; soit l’ADN ; jamais les deux) Ils sont des parasites intracellulaires absolus, et leur réplication dépend de la cellule hôte.  Ils ne possèdent pas d’appareil de traduction, ni de ribosomes.  Ils ne possèdent pas d’information génétique relative au métabolisme énergétique.  ils sont capables de perturber l’information génétique des cellules qu’ils infectent (mais ne provoquent pas obligatoirement la mort cellulaire).  Ce sont des organismes inertes en dehors d’une cellule vivante.  Ils sont capables de se transmettre de cellule à cellule. Tout être vivant est susceptible d’être infecté par au moins un virus (voie aérienne, cutanée, sexuelle ou par ingestion, par voie sanguine).

Corollaire Certains composants du monde vivant ne sont pas des virus, mais s‘en rapprochent : les organites cellulaires (en particulier les mitochondries). les éléments génétiques mobiles formés d’ADN ? (les plasmides et transposons) les viroïdes responsables de pathologies chez les végétaux. les prions (agents transmissibles non conventionnels).

Le virus HIV : Rappel historique et quelques statistiques Histoire naturelle de l’infection par le HIV Organisation des particules virales Le cycle réplicatif du HIV et cibles thérapeutiques

Le virus HIV : Introduction historique Pneumocystis carinii Sarcome de Kaposi Infections opportunistes des cellules blanches (TCD4  500) Immunodépression? Transmission : Sexuelle Sanguine Mère enfant 1981 : CDC Atlanta 1983 1981 : CDC Atlanta 1983 L. Montagnier / R. Gallo : identification du rétrovirus (LAV/HTLVIII, HIV) Biopsie ganglionnaires Contrairement au HTLV1-1 qui immortalise les cellules (oncorétrovirus) il tue les Lymphocytes TCD4 (lentivirus) Voie d ’entrée = récepteur CD4 (  des cellules CD4+) Découverte du HIV-2 (F. Clavel) (moins pathogène/ Afrique de l’ouest) Pandémie mondiale (+ de 40 millions de personnes infectées). Syndrome d ’immunodéficience Acquise (SIDA)

Etat actuel de l’épidémie (1)

Etat actuel de l’épidémie (2)

Etat actuel de l’épidémie (3)

Etat actuel de l’épidémie (4)

Etat actuel de l’épidémie en FRANCE (5) Situation en 2004 - (source : rapport delfraisy) Personnes vivant avec le HIV/SIDA : entre 60 000 et 176 000 Nouveaux cas d'infection à HIV en 2001 : 5 000 Cas de SIDA déclarés depuis le début de l’épidémie : 54 781 Décès dus au SIDA en 2001: 409 Décès dus au SIDA depuis le début de l’épidémie : 32 119 60% des cas traiter = succes virologique

20 ans de lutte contre le VIH 1981 1982 1983 1987 1996 2004 Alerte sanitaire aux USA « SIDA » Isolement du VIH-1 Premier anti-rétroviral, l’AZT Premiers cas de résistance à l’AZT Premiers anti-protéases Apparition de virus multirésistants Situation dramatique en Afrique 20 millions de morts du SIDA 40 millions de personnes infectées

Le virus HIV : Rappel historique et quelques statistiques Histoire naturelle de l’infection par le HIV Organisation des particules virales Le cycle réplicatif du HIV et cibles thérapeutiques

Histoire naturelle de l’infection HIV Evénements cliniques et biologiques se manifestant en dehors de toute intervention thérapeutique 4 phases : La contamination La primo-infection L’infection asymptomatique La maladie

I - La contamination Le virus gagne les ganglions lymphatiques où il se multiplie. Pas de test biologique capable de prouver la présence du virus. En cas de contamination suspectée, il existe un traitement d’urgence: trithérapie devant être débutée dans les 24 h suivant l’acte contaminant et pendant un mois. Voies de contaminations : Sexuelle Sanguine Mère enfant

Résumé

Histoire naturelle de l’infection Destruction des cellules T CD4+ Apparition de maladies opportunistes IMMUNITÉ VIRUS Destruction continue des cellules CD4+ Elimination quotidienne des virus 1010 virus fabriqués/jour Régénération accélérée des cellules CD4+ IMMUNITÉ VIRUS Plusieurs années Phase asymptomatique SIDA

SCHEMA SIMPLIFIE DU DEROULEMENT CINETIQUE DES REPONSES ANTIVIRALES Réponses Immunitaires innées Réponses Immunitaires adaptatives Rapides, peu diversifiées, spécificité dégénérée, efficacité restreinte pas de mémoire lentes, très diversifiées, spécificité haute, efficacité forte mémoire

Les responses immunitaires aux virus : Immunité Intrinsèque défenses antivirales cellulaires : restrictions Apobec3G, FV1, Ref1, Trim5 etc.. Immunité Innée immédiate défenses antivirales cellulaires interférence ARN (destruction des mRNA) ,Voies de la PKR (apoptose et inhibition traduction) Voies TOL Mda5, de Rig-I et DAI … émission de signaux de dangers ligands de NKG2D, IFN-/ … Système immunitaire adaptif: Lymphocytes T CD8 (lyse des cellules infectées), LT CD4, Lymphocytes B: anticorps (neutralisants, facilitants, ADCC) Effets néfastes pour l’hôte: immunopathologie

Pathogénèse du HIV SIDA Plusieurs années VIRUS Défenses de l’hôte Phase asymptomatique SIDA Plusieurs années VIRUS Efficacité réplicative du virus Echappement au SI Cellules cibles : CD4 contrôle de la variabilité hyper glycosylation AC facilitants Latence Disfonctionnement du SI Contrôle de l’immunité innée Effet cytopathogène cyncitas Nef Défenses de l’hôte Contrôle par le SI Anticorps Cellules T cytotoxiques Défense cellulaire (immunité innée et intrinsèque) Apobec 3G contrôle de l’uracilation de L’ADN

Le virus HIV : Rappel historique et quelques statistiques Histoire naturelle de l’infection par le HIV Organisation des particules virales Le cycle réplicatif du HIV et cibles thérapeutiques

Structure du virion

Structure du virion

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Cycle d’infection par le HIV

Cycle de réplication du VIH-1 Fixation au récepteur et au co-récepteur Noyau Cytoplasme

Identification du récepteur CD4 : L’infection HIV induit une diminution du nombre de Lymphocytes T CD4+ Des anticorps monoclonaux dirigés contre le CD4 bloquent l’infection in vitro La GP120 co-immunoprécipite avec le récepteur CD4 L’incubation du virus avec du CD4 recombinant titre l’infection HIV Des cellules HeLa ne sont pas infectables par le HIV-1; elles le deviennent après transfection du gène codant pour le récepteur CD4 Une énigme subsiste : Des cellules de souris qui ne sont pas infectables par le HIV-1 restent insensibles après transfection du gène codant pour le récepteur CD4 Certaines cellules CD4+ humaines sont non infectables par le HIV IL DOIT EXISTER UN CO-RÉCEPTEUR

Comment inhiber l’entré du virus

Cycle de réplication du VIH-1 Noyau Cytoplasme Fixation au récepteur et au co-récepteur Décapsidation

Cycle de réplication du VIH-1 Fixation au récepteur et au co-récepteur Décapsidation Noyau Cytoplasme Rétrotranscription

La rétrotranscription Mécanismes d’action des inhibiteurs de la RT 2 types d’inhibiteurs (modes d’action différent) Analogues de bases = Terminateurs de chaînes Exemples : les inhibiteurs nucléosidiques (NRTI) Les nucléotidiques (NtRTI) Inhibition par par modification du site catalytique de la RT Les inhibiteurs non nucléosidiques (NNRTI),

Mode d’action de L’AZT N3 N3

Les analogues de base (NRTI et NtRTI) Les nucléosides (analogues de base non phosphorylés) Les nucléotides (analogues de base phosphorylés)

Inhibiteur non nucléosidiques de la RT Les informations structurale permettent de comprendre leur mode d’action. RT + Inhibiteur Non nucléosidique RT + ADN

Cycle de réplication du VIH-1 Fixation au récepteur et au co-récepteur Décapsidation Rétrotranscription Noyau Cytoplasme Transport au noyau

Cycle de réplication du VIH-1 Fixation au récepteur et au co-récepteur Noyau Cytoplasme Décapsidation Rétrotranscription Cellules infectée est un « provirus » Intégration Transport au noyau

L’intégration Lorsque la RT est finie, l’intégrase se repositionne aux extrémités du LTR, un dimère par LTR. D’autres protéines (NC et protéines cellulaires sont associées). Elle enlève 2 bases à l’extrémité 3’OH (3’ end-processing). Le 3’OH de chacun des brins fait une attaque nucléophile sur l’ADN cellulaire et coupe en quinconce. Des activités cellulaires (flap endonuclease, polymerase, ligase) réparent et dupliquent les 4 à 6 bases du quinconce. L’intégration se fait au hasard dans le chromosome (débat sur région + ou -transcriptionnellement active)

Structure de l’intégrase Structure cristalline recherchée depuis 15 ans sans succès. Seul des domaines isolés sont connus. Protéine native quasi-insoluble et partiellement active. 3 domaines, Zinc binding en N-term, Core catalytique central et C-term domaine qui est plus variable Anti IN en phase II et I prochainement

Cycle de réplication du VIH-1 Régulation latence post integrative/expression des virus Fixation au récepteur et au co-récepteur Décapsidation Rétrotranscription Intégration Transport au noyau Noyau Cytoplasme

Fonctions promotrices du LTR 5’ Certains facteurs de régulation sont spécifiques d’espèces et/ou de type cellulaires. Donc, outre le récepteur, les facteurs de transcription déterminent aussi la réplication virale dans une cellule/tissu/ou espèce. La concentration intra-nucléaire de ces facteurs est très contrôlée par l’état d’activation cellulaire. Le niveau d’expression du virus sera aussi très dépendant de l’activation et/ou la différentiation cellulaire

Transactivation par des facteurs viraux

Cycle de réplication du VIH-1 Fixation au récepteur et au co-récepteur Décapsidation Rétrotranscription Intégration Transport au noyau Noyau Cytoplasme Traduction assemblage

Maturation protéolytique de Gag ? Inhibiteurs

Les inhibiteurs de la protéase virale Premier inhibiteur de la protéase disponible en 1997 La protéase clive les protéines virales précurseurs en protéines matures Fixation des IP sur le site catalytique  inhibition réversible de la protéase

Maturation des particules virales Le clivage protéolytique des précurseurs viraux permet de résoudre le paradoxe de l ’encapsidation/décapsidation

Les inhibiteurs de la protéase

Maturation de la particule HIV-1

Cycle de réplication du VIH-1 Bourgeonnement Fixation au récepteur et au co-récepteur Décapsidation Rétrotranscription Intégration Transport au noyau Noyau Cytoplasme

La machinerie de bourgeonnement 4 Vps4 Virus Ub Ubiquitine Ub ESCRT-III Tsg101 ESCRT-I Ub ESCRT-II Ub MVB Ub Tsg101 4

Actions des anti-rétroviraux sur le cycle viral Résumé : Actions des anti-rétroviraux sur le cycle viral INHIBITEURS DE L’IN INHIBITEURS DE L’ENTREE INHIBITEURS DE LA RT ANTI-PROTÉASES

Actions des anti-rétroviraux sur le cycle viral Résumé : Actions des anti-rétroviraux sur le cycle viral CIBLES des ANTIVIRAUX Enzymes virales du complexe de réplication Polymérases Intégrases capping Autres enzymes virales protéases virales Neuraminidases Fixation entrée Protéines virales régulant l'immunité innées ou acquise immuothérapies

Pourquoi les multithérapies sont elles plus efficaces? Probabilité de sélectionner un virus résistant (noir) Vitesse de réplication virale Concentration en antiviral nulle sub optimal optimal toxique dose a maintenir durant tout le traitement

Rappel immunité acquise