Techniques immunologiques Plan du cours A) Propriétés du complexe anticorps/antigène Immunodiffusion Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble: ELISA et Westernblot "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux (Facs) IgE: RIST et RAST Détection de complexes immuns: test au C1q B) Propriétés du complément CH50 C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte

A) anticorps/antigène Immunodiffusion anticorps + antigène +++ anticorps++ antigène ++ anticorps+++ antigène + équivalence Ac polyclonal Ac monoclonal Précipitation

A) anticorps/antigène Immunodiffusion anticorps+antigène précipitation Visalisation sur gel (bleu de comassie) Ouchterlony Immunoélectophorèse

Ouchterlony Sensibilité: 20-200µg/ml Équivalence: précipité bleu

Ouchterlony Intérêt surtout historique (savoir que c’est une technique basée sur la diffusion et la précipitation mais les détails ne sont pas matière d’examen) Permet la comparaison directe de différents antigènes (par exemple les déterminants antigéniques de l’albumine de deux espèces voisines sont-ils différents ou partiellement semblables?)

Ouchterlony Un puits central dans lequel on introduit les anticorps (aussi appelés antisérum) Des puits périphériques équidistants dans lesquels on introduit les antigènes à évaluer Si une seule protéine (ou un seul polysaccharide) est reconnu par l’antisérum : 1 bande; si deux protéines de PM différents sont reconnues : 2 bandes La bande la plus proche du puits central correspond à l’antigène qui a migré le plus vite (qui est donc le plus petit)

Ouchterlony Si on dépose des préparation différentes dans les puits périphériques, on compare les courbes de précipitation en regard de chaque puits périphérique Lorsqu’on dépose la même protéine (ou le même polysaccharide) dans deux puits adjacents, les traits de précipitation vont se rejoindre : c’est la réaction d’identité

Ouchterlony Si deux protéines (ou polysaccharides) différents mais partageant un déterminant antigénique sont introduites dans deux puits périphériques adjacents, les traits de précipitation fusionnent mais on note une projection qui prolonge le précipité formé par la réaction principale : cette projection est due à des anticorps qui reconnaissent des déterminants antigéniques qui ne sont pas présents dans les deux solutions : c’est la réaction d’identité partielle

Quizz: Ouchterlony -g chains - l chains - F(ab) - k chains - Fc from IgG with k chains - A mixture of g heavy and k chains -g chains

Réponses au Quizz (just for the fun) 1 Fab : identité partielle avec 2 2. Chaînes g Identité avec ligne externe de 3 3. Mélange de chaînes g et de chaînes légères k deux bandes distinctes car les protéines ont des PM différents et ne diffusent pas de la même façon La ligne la plus proche du puits central : k (identité avec 4) L’autre ligne : la protéine la plus lourde g 4. Chaînes k Absence d’identité avec 5 Réaction d’identité avec une des protéines 3 5. Chaînes l Reconnaissance mais absence d’identité avec 4 6. Portion Fc d’une IgG possédant des chaînes k Aucune reconnaissance (pas de bande)

Quizz: Ouchterlony

Immunoélectrophorèse A) anticorps/antigène Immunodiffusion Immunoélectrophorèse Mélange d'antigènes trop complexe (beaucoup de molécules de poids moléculaires très voisins) Séparation des Ag selon leur charge avant d’être détecter par précipitation

Immunoélectrophorèse Puits contenant la mixture d'Ag Déplacement des ≠ Ag Diffusion des Ac Technique qualitative peu sensible (>100µg/ml)

Immunoélectrophorèse Utilisation: Sérum (IEP-sérum) ou urine (IEP-urine) Immunoglobulines Albumine Transferrine Détection Immunoglobulines Détection d’immunodéficience: faible quantité d’un ou plusieurs isotypes Polyclonal ou monoclonal

A) anticorps/antigène Immunodétection IgM IgG Radioactif Enzyme/Chromogène Fluorescence

A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA Westernblot Sérum Urine Surnageant de culture Etc.

enzyme-linked immunosorbent assay A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay Enzyme/Chromogène

Exemple: détection d'Ac anti-HIV ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Sensibilité: 10-1000 pg/ml

ELISA Détection Ac ELISA sandwich Détection Ag Ac de capture

A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble Westernblot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel Détection par Ac (présent dans le sérum du patient) Détection de Ac par un Ac marqué Exemple: détection des faux positifs HIV (détecté par Elisa)

Exemple: détection d'Ac anti-HIV Westernblot Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Protéines HIV Patient A: négatif Patient B: indéterminé Patient C: positif Pos Neg patients

"Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux Immunohistochimie Cytométrie en flux (FACS)

"Ag" liés aux cellules : sur coupe A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Principe indirecte directe

A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage actine, tubuline et noyau

Maladie de Goodpasture (dépôts linéaires d’IgG et de C3b)

A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: infiltration CD4 dans une tumeur Nég Pos

"Ag" liés aux cellules : sur coupe A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage Fas Pos Nég

A) anticorps/antigène Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Anticorps anti-nucléaire Sérum patient Cellules test

A) anticorps/antigène Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Anticorps anti-nucléaire

A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules en flux Cytométrie en flux FACS = fluorescence activated cell sorter

Cytométrie en flux (FACS) A) anticorps/antigène Immunodétection Cytométrie en flux (FACS) Principe directe indirecte

FACS 3000 cellules/sec

FACS Sang "granulosité" Taille

FACS Sang Th Fluorescence orange Tc Fluorescence verte

Avantages et inconvénients Facs versus coupe FACS: Rapidité d'analyse Multi-couleurs Possibilité de tri Coupe: Localisation Interaction entre ≠ cellules

A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RIST et RAST Atopie

A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RIST RIST = radioimmunosorbent test quantification des IgE totales

A) anticorps/antigène Immunodétection RIST = quantification des IgE totales

A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RAST RAST = radioallergesorbent test quantification des IgE spécifiques

A) anticorps/antigène Immunodétection RAST = quantification des IgE spécifiques

A) anticorps/antigène Immunodétection Test au C1q Le complexe C1

La liaison de C1q à deux Ig ou plus n’est possible que si ces dernières appartiennent à un même complexe immun ou si elles sont fixées sur une même surface

A) anticorps/antigène Immunodétection Test au C1q C1q Ac libre Complexe immun

Mesure l'activité fonctionnelle du complément B) Propriétés du complément CH50 Mesure l'activité fonctionnelle du complément

Lyse de la cellule cible Voie lectine complément C3 Voie classique C1, C4, C2 Amplification P, B, D Voie alterne P, C3, B, D C3b Lyse de la cellule cible C5-C9

B) Propriétés du complément CH50 Sérum patient Globule rouge sensibilisé par Ac Destruction du globule rouge

B) Propriétés du complément CH50 Sérum patient Complément Quantification: quantité de sérum nécessaire pour lyser 50% des globules rouges

B) Propriétés du complément CH50 Sérum patient Complément Quelle(s) protéine(s) du complément est (sont) absente(s) ou non fonctionnelle(s)?

B) Propriétés du complément

C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte (MLR)

C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Les lymphocytes sont-ils capables de répondre à un mitogène non spécifique? Détection immunodéficience

Comment observer les réponses des lymphocytes T in vitro? Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Radioactivité Quantité d’antigène

Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène? Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Mitogène 60 50 40 Radioactivité 30 20 10 2.5 5 7.5 10 Mitogène

Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène? Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Radioactivité Patient immunodéficient Mitogène

Greffe C) Réponses lymphocytaires Cultures mixtes (MLR)? Les lymphocytes d'un patient réagissent-elles contre les cellules du donneur ? Greffe

Prolifération lymphocytaire Cellules donneur (irradiées) Pas de réaction Radioactivité 60 50 Réaction receveur-donneur Radioactivité 40 30 20 10 Cellules receveur 2.5 5 7.5 10 Cellules du donneur