Gain de fonction, perte de fonction

Puce à ADN Discovery-driven research gène x = candidat Comparaison ARNm de cellules à division rapide Vs ARNm de cellules à division lente gène x = candidat hypothesis-driven research Ce gène active la division cellulaire

Gain de fonction Sur-expression 24 h après expression physiologique Produit de gène x Sous-expression Perte de fonction

Gain de fonction perte de fonction Organisme Cellule Transgénique Knock Out Cellule sur-expression sous-expression

Approche : Gain de fonction Sur-expression expression physiologique Produit de gene x = protéine x protéine x macromolécule informationnelle ARNm codant protéine x ADN codant protéine x

ADN codant protéine x ARNm codant protéine x protéine x transcription traduction protéine x

? - Source de la macromolécule informationnelle ? - Introduction dans la cellule

d’une source biologique Source de la macromolécule informationnelle ADN PCR, Clonage ARN Transcription in vitro Purifiée à partir d’une source biologique Protéine Protéine recombinante

Promoteur d’ARN polymérase Transcription in vitro Plasmide Promoteur d’ARN polymérase de bactériophage recombinant ADN codant protéine x

Transcription in vitro recombinant Transcription in vitro Plasmide ARN polymérase de bactériophage ARN

Protéine recombinante Escherichia coli Promoteur bactérien Plasmide ADN codant protéine x recombinant Transfection Extraction et purification Protéine x

* * * Introduction dans la cellule Transfection Transformation Transfert de matériel génétique exogène dans une cellule. * Transformation Acquisition par un organisme de caractères héréditaires nouveaux après pénétration dans ses cellules de matériel génétique exogène. * Transduction Transfert de matériel génétique d'une bactérie à une autre ou d'une cellule à une autre par l'intermédiaire d'un virus.

La membrane plasmique est une barrière physique à la transfection de protéines et acides nucléiques

Paroi bactérien (gram -) Lipopolysaccharides peptidoglycan Membrane Plasmique intérieur extérieur Périplasme lipoprotéine Porine (protéine) Transporteur (protéine)

Paroi de lévure

Paroi d’une cellule végétale pectocellulosique Membrane plasmique

Production de protoplastes Cellule végétale Digestion enzymatique

Production de sphéroplastes levure Digestion enzymatique

Comment faire pénétrer une macromolécule Informationelle à l’intérieure d’une cellule ? Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Fusion membranaire

- Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc - Endocytose - Fusion membranaire

Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - artificielle - biologique - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc

Micro-injection : artificielle

transfection de populations de cellules impossible Micro-injection : artificielle Avantages : transfection très efficace Inconvénients : lourdeur technique transfection de populations de cellules impossible

Micro-injection : biologique : bactéries Bactériophage T7 M13 Pilus F Bactériophage M13

Micro-injection : biologique : cellules végétales galles Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium : cycle de vie

Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc

Choc-osmotique/choc-thermique bactérie levure CaCl2 Cl- Ca++ LiCH3CO2 Li+ CH3CO2- turgescence H2O perméabilisation 37°C 42°C ADN

transfection de populations de cellules Choc-osmotique/choc-thermique Avantage : Peu onéreuse transfection de populations de cellules Inconvenients : faible efficacité toxicité échanges non-spécifiques d’autres molécules

Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc

Electroporation - + 10 - 100 kV/cm 10 - 1000 s

Electroporation résistance alimentation Interrupteur # 1 capacitance

Electroporation Avantage : Inconvenients : efficacité de transfection transfection de populations de cellules Inconvenients : toxicité échanges non-spécifiques d’autres molécules

Biolistique …… . microbilles en or hélium hélium Rupture de la membrane calibrée Capsule à microbilles Grille de rétention cellules microbilles en or Biolistique hélium transfectées . Rupture de la hélium Onde de choc

Biolistique

Biolistique Avantage : Inconvenients : Utilisation avec cellules à paroi transfection de populations de cellules Inconvenients : Endommage les cellules Transfection peu uniforme

Nanosecond pulsed laser-induced stress wave

Technique trop récente Nanosecond pulsed laser-induced stress wave Avantage : ? Technique trop récente ? Inconvenients :

Agrolistique

Comment faire pénétrer une macromolécule Informationelle à l’intérieure d’une cellule ? Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Fusion membranaire

Endocytose L’endocytose implique la capture spécifique de macromolécules ou nanoparticules par la membrane plasmique

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose : Peptides cationiques R Q I K I W F Q N R R M K W K K + de la protéine antennapaedia R Q I K I W F Q N R R M K W K K + de la protéine tat de VIH G R K K R R Q R R R P P Q C + - oligo arginine R R R R R R R R R + Peptides passe-membranes (cell-penetrating peptides : CPP)

CPP (conjugaison chimique) (liaison covalente) G R K K R R Q R R R P P Q C cargo Protéine ARN ADN CPP (peptide de synthèse)

CPP (protéine de fusion recombinante) Plasmide recombinant ADN codant CPP ADN codant protéine x Transfection dans E.coli RQIKIWFQNRRMKWKK- Protéine x

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose : Phosphate de calcium ADN ARN Protéine ? 3 CaCl2 + 2 Na3PO4 Ca3PO4 + 6NaCl Membrane plasmique + + - - - - + - + + + + - - + - + + - endosome - - + + - + Précipitée Ca3PO4 / ADN nanoparticulaire nanoparticules

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose : Polymères ramifiés ADN ARN Protéine ? + Polyéthylénimine (PEI) Complexe PEI / ADN nanoparticulaire

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose : lipides amphipathiques région cationique région lipidique + région cationique région lipidique (hydrophobe) Lipoplexe (nanoparticule) example : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose : peptides amphipathiques + - région hydrophobe région cationique + - p K E T W W E T W W T E W S Q P K K K R K V C Pep-1

Endocytose : peptides amphipathiques + Nanoparticule de Pep-1/cargo (protéine)

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose : nanoparticules hydrophobes ADN ARN Protéine Lipofection

Endocytose Macromolécules cationiques Nanoparticules - cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus

Endocytose : nanoparticules : virus recepteur membranaire ligands membranaires : virus virus recepteur membranaire virus

Les virus db ADN sb sb+ ARN sb- Génome Famille Adenoviridae Poxviridae Herpesviridae db Adenoviridae ADN sb Parvoviridae Coronaviridae sb+ Retroviridae Picornaviridae ARN Rhabdoviridae sb- Filoviridae Réoviridae

Les virus db ADN sb sb+ ARN sb- Génome Famille Adenoviridae Poxviridae Herpesviridae db Adenoviridae ADN sb Parvoviridae Coronaviridae sb+ Retroviridae Picornaviridae ARN Rhabdoviridae sb- Filoviridae Réoviridae

Endocytose : nanoparticules : Adenoviridae ligands membranaires : virus Adenoviridae Ligands de protéines membranaires :

Endocytose : nanoparticules : Adenoviridae ligands membranaires : virus Adenoviridae

Endocytose : nanoparticules : Adenoviridae ligands membranaires : virus Adenoviridae

Endocytose : nanoparticules : Adenoviridae E1 déleté ligands membranaires : virus Adenoviridae E1 déleté = réplication incompétente

Endocytose : nanoparticules : Adenoviridae transgène ligands membranaires : virus Adenoviridae transgène

Cellules transformées par E1  E1 genome avec transgène promoteur transfection plasmide Cellules transformées par E1 réplication incompétente transgènique virus

transduction très efficace grande tropisme Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus Adenoviridae Avantages : transduction très efficace grande tropisme Inconvénients : Expression transitoire Sécurité

Les virus db ADN sb sb+ ARN sb- Génome Famille Adenoviridae Poxviridae Herpesviridae db Adenoviridae ADN sb Parvoviridae Coronaviridae sb+ Retroviridae Picornaviridae ARN Rhabdoviridae sb- Filoviridae Réoviridae

Retroviridae Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus

Retroviridae Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus LENTIVIRUSES … this slide in your handout as a review. The genus lentivirus is a member of the retrovirus family, and is unique for two main reasons: 1) they have regulatory sequences that keep them slow acting 2) they have the unique ability to infect non-dividing cells (such as macrophages) Recall that retroviruses are RNA viruses with reverse transcriptase activity and that they are enveloped, which makes them better evaders of the immune system. Since this is review, we won't go into the details of replication.

transduction très efficace Expression stable (intégration) Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité

transduction très efficace Expression stable (intégration) Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité

Retroviridae Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus LENTIVIRUSES … this slide in your handout as a review. The genus lentivirus is a member of the retrovirus family, and is unique for two main reasons: 1) they have regulatory sequences that keep them slow acting 2) they have the unique ability to infect non-dividing cells (such as macrophages) Recall that retroviruses are RNA viruses with reverse transcriptase activity and that they are enveloped, which makes them better evaders of the immune system. Since this is review, we won't go into the details of replication.

transduction très efficace Expression stable (intégration) Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité

rétrovirus : défective pour la réplication Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae rétrovirus : défective pour la réplication

Plasmide LTR gag/pol env transfection Cellule productrice

U3 R U5 transgene 3’ LTR inactive promoteur Recombinaison pendant transcription inverse U3 R U5 transgene 5’ LTR auto-inactivé

Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente)

Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente)

étiquetage (epitope tagging) HIS HHHHHH c-MYC EQKLISEEDL HA YPYDVPDYA VSV-G YTDIEMNRLGK HSV QPELAPEDPED V5 GKPIPNPLLGLDST FLAG DYKDDDDK étiquetage (epitope tagging) Plasmide ADN codant étiquette Protéine x promoteur

Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente)

Green Fluorescent Protéine (GFP) dsRED Etiquetage Green Fluorescent Protéine (GFP) dsRED

Co-marquage co-transfection co-traduction (IRES)

mTrim17 Pcmv his6 SV40 polyA ires YFP his6 YFP 

expression transitoire ou expression stable

expression transitoire

expression stable Nécessite une intégration génomique rétrovirus intégration fortuite Événement rare sélection

ADN x polyA Gene de résistance antibiotique promoteur 1 promoteur 2

expression inductible P CMV tTA-NLS doxycycline Tet repressor/TA tetO P CMVmin Gene x SV40 polyA

expression inductible P CMV rtTA-NLS doxycycline Reverse Tet repressor/TA tetO P CMVmin Gene x SV40 polyA