Phases précoces de l’infection Phases tardives de l’infection HIV-1 SU TM vpr env PR RT IN R R U5 pro-pol tat nef U3 R Psi gag vif vpu 5’ LTR MA CA NC p6 rev 3’ LTR SU TM HIV-2, SIVsm, SIVmac vpx vpr env PR RT IN R R U5 pro-pol tat nef U3 R Psi gag vif 5’ LTR MA CA NC p6 rev 3’ LTR B Bourgeonnement Entrée Assemblage Récepteur cellulaire ADN proviral Traduction des ARNm Transcription inverse ARN viraux Intégration Noyau Phases précoces de l’infection Phases tardives de l’infection Figure 1: Structure génétique (A) et cycle réplicatif (B) des lentivirus. L'ARN génomique des lentivirus de primates est encadré par les LTR (long terminal repeat) et comprend les 3 gènes principaux gag, pro pol et env ainsi que les gènes régulateurs tat et rev et accessoires vif, vpr et nef. Certaines souches de lentivirus comme HIV-2, SIVsm (sooty mangabey) ou SIVmac (macaque) possèdent aussi le gène accessoire vpx. Le cycle réplicatif lentiviral débute par les phases précoces de l'infection: reconnaissance de la glycoprotéine d'enveloppe du virus avec le récepteur cellulaire, entrée du complexe nucléoprotéique dans le cytoplasme, tanscription inverse, import nucléaire de l'ADN proviral et intégration dans le génome cellulaire, puis les phases tardives permettent la transcription des ARN viraux et la traduction des protéines virales, leur assemblage et la formation de nouvelles particules virales libérées hors de la cellule.

vpx + vpr vpr vpr vpx + vpr vpx + vpr vpr vpx + vpr HIV-1 groupe M HIV-1 groupe N vpr HIV-1 groupe O vpx + vpr vpx + vpr vpr Hu et al. 2003. Figure 2: Arbre phylogénétique des lentivirus de primates. (Hu et al 2003). Cet arbre a été construit par la méthode du maximum de vraisemblance à partir d'un fragment conservé du gène pol. Les lentivirus de primates actuellement connus sont divisés en 7 lignées (SIVsm/HIV-2, SIVagm, SIVcpz/HIV-1, SIVmnd, SIVdrl et SIVlhoest, le code de lettres minuscules indiquant l'espèce hôte) dont 4 possèdent le gène vpx (SIVsm/HIV-2, SIVrcm, SIVmnd et SIVdrl).

A B SIVMAC + Vpx - Vpx 100 100 10 10 1 1 0,1 0,1 1x 10x 1x 10x HIV-1 Cellules dendritiques Macrophages 100 100 10 10 % d'infection 1 1 0,1 0,1 1x 10x 1x 10x B HIV-1 + Vpr - Vpr Cellules dendritiques Macrophages 100 100 10 10 % d'infection 1 1 0,1 0,1 1x 10x 1x 10x Figure 3: Vpx est nécessaire pour l'infection des cellules dendritiques humaines par SIV. Des cellules dendritiques (DCs) ou des macrophages humains ont été transduits par des vecteurs lentiviraux dérivés du SIV (A) ou du HIV-1 (B) dépourvus de gènes accessoires ou possédant la protéine accessoire Vpx du SIV (A) ou Vpr du HIV-1 (B) avec deux quantités de vecteurs (1x ou 10x) normalisés par leur contenu protéique. Le pourcentage de cellules transduites a été mesuré 3 jours plus tard par mesure de l'expression du gène rapporteur gfp apporté par les vecteurs viraux, par cytomérie de flux.

Cellule productrice du vecteur A Virus original env pro-pol gag LTR 5' LTR 3' LTR 5' gène rapporteur LTR 3' gag pro-pol Psi VSV-G pCMV eGFP pCMV pCMV Vecteur Enveloppe Vecteur auxiliaire Lentivecteur B Lentivecteur Plasmides Transfection des 3 ADNs Transduction Expression du transgène Gfp Vecteur Enveloppe Cellule productrice du vecteur Cellule cible Vecteur auxiliaire Figure 5: Principe des lentivecteurs. A: La séquence du génome viral est répartie sur 3 plamides différents: l'un joue le rôle de génome et comporte les séquences cis permettant sa mobilisation, ainsi qu'une casette contenant un gène rapporteur (ici l'eGFP: enhanced Green Fluorescent Protein) sous le contrôle du promoteur CMV. Un deuxième plasmide contient un gène d'enveloppe (ici la protéine G du VSV permettant un large tropisme cellulaire). Enfin un troisième plasmide code les gènes gag et pro-pol des protéines de structure et des enzymes virales respectivement. B: La transfection de ces 3 plasmides dans une lignée cellulaire productrice de vecteurs permet la formation de particules contenant toutes les protéines virales présentes chez le virus sauvage alors que le génome encapsidé ne code que le gène rappoteur. Les cellules cibles transduites par les vecteurs produits expriment donc uniquement le gène rapporteur.

2. Purification des vecteurs produits sur double coussin de sucrose Plasmides génome 2. Purification des vecteurs produits sur double coussin de sucrose 1. Transfection 3. Normalisation des vecteurs par titre infectieux gag pol Mesure de la GFP. Calcul du nombre de particules infectieuses par ml de préparation. enveloppe pantropique VSV-G cellule 293T cellule HeLaP4 vpx 4. Transduction des DCs à MOI 5 IL-4 GM-CSF Mesure de la GFP 4 jours Monocyte DC Figure 6: Représentation schématique des étapes de la production des lentivecteurs et de la transduction des DCs. Les plasmides sont cotransfectés dans des cellules 293T. Deux jours plus tard le surnageant des cellules est centrifugé sur double coussin de sucrose afin de purifier les lentivecteurs produits. Les lentivecteurs sont ensuite titrés sur cellules HeLaP4 puis normalisés par titre infectieux pour transduire des DCs différenciées à partir de monocytes du sang cultivés 4 jours en présence d'IL4 et de GM-CSF à une MOI (multiplicity of infection ou nombre de particules infectieuses par cellule cible) déterminée.

Tableau 1: ADNs utilisés pour le clonage des gènes vpx des souches SIVsmBPj, SIVsm660, SIVhu, SIVrcm, HIV-2ROD et des gènes vpr des souches SIVagm et HIV-1bcf. Une PCR a été réalisée avec chaque couple d'amorce sur une matrice d'ADN proviral plasmidique lorsqu'il était disponible ou d'ADN obtenu après transcription inverse de l'ARN viral. Les produits de PCR ont ensuite été digérés par les couples d'enzymes correspondants et introduits dans le plasmide pcDNA3+ (Invitrogen). La séquence de chacun des gènes amplifiés a été vérifiée.

A B C D CA Vpx CA Vpx SIVsm660 Vpx SIVsm PBj Vpx SIVhu Vpx SIVmac Vpx HIV-2 Vpx SIVrcm aucun Vpx Vpx SIVmac kDa 64,2 48,8 37,1 25,9 CA 19,4 14,8 Vpx Vpx SIVhu Vpx SIVmac Vpx SIVsm660 Vpx SIVsm PBj Vpx HIV-2 aucun Vpx Vpx SIVrcm C D aucun Vpr Vpr SIVmac Vpr SIVagm kDa 37,1 25,9 CA 19,4 14,8 aucun Vpr Vpx SIVmac Vpr SIVmac Vpr SIVagm Figure 7: Restauration dela transduction des DCs par un vecteur SIVmac en présence de Vpx ou Vpr de différentes souches de lentivirus. Des DCs humaines ont été transduites à une MOI de 5 par des vecteurs SIVmac minimaux auquels ont été apportés en trans l'un des Vpx (A) ou des Vpr (B) des souches de lentivirus indiquées. Dans les deux cas un contrôle a été réalisé avec un vecteur SIVmac minimal. Le pourcentage de restauration de la transduction des DCs est indiqué pour chaque Vpx, par rapport à Vpx de SIVmac servant de référence. B et D: Analyse de l'incorporation des Vpx (B) ou Vpr (D) dans les particules virales SIVmac par empreinte western réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par rest d'activité transcriptase inverse exogène. Les anticoprs utilisés sont dirigés contre la protéine p27 de la capside (CA) du SIVmac, contre Vpx du HIV-2 (B) ou contre Vpr du HIV-1 (D).

A B 37,1 25,9 CA 19,4 14,8 Vpx HIV-2 délété HIV-2 sauvage Vpx SIV mac aucun Vpx Vpx HIV-2 37,1 25,9 CA 19,4 14,8 Vpx aucun Vpx Vpx HIV-2 SIVmac Vpx HIV-2 sauvage HIV-2 délété Figure 8: Défaut de transduction des DCs humaines par un vecteur HIV-2 délété et restauration de la transduction par l'apport de Vpx du SIVmac. Des DCs humaines ont été transduites à des MOI de 5 ou 25 par un lentivecteur HIV-2 contenant tous les gènes accessoires (A, HIV-2 sauvage), ou possédant une délétion touchant vpx et vif (A, HIV-2 délété, aucun Vpx), auquel ont été apportées en trans les protéines Vpx du HIV-2 ou du SIVmac. (B) Une empreinte western a été réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par titre infectieux sur cellules HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un anticorps dirigé contre Vpx du HIV-2.

A B HIV-1MVP aucun Vpr Vpr HIV-1 bcf kDa 82,2 64,2 48,8 37,1 25,9 CA 19,4 HIV-1 8.91 14,8 aucun Vpr Vpr HIV-1BCF HIV-1MVP Figure 9: Le vecteur HIV-1MVP peut trasduire les DCs sans gène accessoire. A: Des DCs humaines ont été transduites à des MOI de 5 ou 25 par les lentivecteurs minimaux HIV-1 8.91 ou HIV-1MVP auquel a pu être apporté en trans la protéine Vpr du HIV-1BCF, appartenant comme HIV-1MVP au groupe O du HIV-1. B: Une empreinte western a été réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par titre infectieux sur cellules HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un anticorps dirigé contre Vpr du HIV-1.