3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie Université de Rouen- Maison de l’université 3 et 4 Juin 2004 Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantes Hervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand

Le Cryo-SEM en qqes mots: SEM classique (Philips SEM 505) Étage cryogénique T < -80°C (Hexland CT 100) Observation Métallisation En dessous du point de sublimation de la glace Observation d’échantillons hydratés mais congelés Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation (méthode directe)

Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal Épiderme d’une feuille Photos: C Bodet

Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal Coupe d’une feuille (cryo-fracture) Photos: C Bodet

Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal Anatomie d’une aiguille de Pin

Circulation des sèves dans l’arbre H2O Sève brute Eau Ascendante Xylème Croissance de l’arbre CO2 Sève élaborée Riche en sucres Descendante Phloème

Deux phénomènes à mettre en évidence Présence de bulles d’air dans les vaisseaux conducteurs (embolie) Normal Collapsé Déformation de la paroi des vaisseaux (collapse) From: Piquemal et al 1998

Observation du xylème au SEM Échantillons prélevés et déshydratés

Observation du xylème au cryo-SEM Risques de sublimation de la glace (cryo-décapage ou métallisation)

Observation du xylème au cryo-SEM Échantillons prélevés puis congelés Cryo-fracture Cryo-microtome LN2 Betula platyphylla, Utsumi et al 1998

La nombre de vaisseaux embolisés dépend du point d’observation Pétiole de Noyer Nombre de vaisseaux embolisés millimètres Distance à la coupe Tyree, Cochard, Cruiziat PCE 2003.

Circulation de la sève brute Évaporation Sol : Eau diluée Xylème: Tubes Parois rigides Feuilles: Surface poreuse Feuilles : Pompe aspirante

Un système vasculaire sous tension (dépression) La sève brute est aspirée par dépression La « pompe aspirante » se désamorce L’appareil vasculaire s’embolise Sol : Eau diluée

Terminaison de vaisseau Perturbation du contenu des vaisseaux lors du prélèvement des échantillons L’appareil vasculaire est constitué de conduits de dimensions variables mais finies Photo: C Bodet, INRA-PIAF vaisseau Terminaison de vaisseau La sève se retire sur toute la longueur des vaisseaux

Observation du xylème au cryo-SEM Échantillons congelés sur l’arbre puis prélevés LN2 Cryo-SEM Cochard et al Plant Physiol 2000

Observation du xylème au cryo-SEM Échantillons congelés sur l’arbre puis prélevés

Le paradoxe du Cryo-SEM -0.7 MPa -0.7 MPa >-0.03 MPa! Les mesures de tension de sève sont-elles erronées ? Les observations au cryo-SEM sont-elles erronées ?

Importance du mode préparatoire des échantillons Échantillons recoupés sous eau puis congelés Cryo-SEM LN2 Water

Variations journalières d’embolie dans un pétiole de noyer LN2 Water +

Vitesse de congélation des échantillons par LN2 T,°C Artéfact de congélation LN2

Étude des phénomènes de collapse LN2 Collapsus des parois Cochard et al, Plant Physiol 2004

Aiguille bien hydratée Mise en évidence du phénomène de collapse par cryo-SEM dans des aiguilles de Pinus cembra Aiguille bien hydratée

Aiguille fortement déshydratée Pinus cembra -4 MPa

Aiguille très fortement déshydratée Pinus cembra -4.6 MPa

Importance du mode préparatoire des échantillons LN2 LN2 Eau 2 min

Conclusions Pour le xylème: la fiabilité des observations est très dépendante de la préparation des échantillons. Possibilités d’artéfacts et d’interprétations erronées des observations. Embolie : recouper sous eau Collapse : ne pas recouper sous eau ! Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation ?