CYTOMETRIE EN FLUX: DEFINITION ET APPLICATIONS CLINIQUES La cytométrie en flux est une technologie qui permet l'analyse quantitative, non destructive et rapide de cellules isolées considérées individuellement: 100.000 cellules par minute Le cytomètre à flux détecte la fluorescence de marqueurs moléculaires présents à la surface ou à l'intérieur des cellules: - Marqueurs membranaires révélés par immunofluorescence: - Leucémies, typage lymphocytaire, immunophénotype - Marqueurs nucléaires révélés par une sonde fluorescente: - Quantification des acides nucléiques (ADN, ARN) - Cinétique cellulaire des tumeurs. Certains cytomètres à flux sont aussi des trieurs de cellules qui sont alors récoltées, intactes, avec un très haut degré de pureté

L’analyse (et le tri) ne se limite pas aux cellules humaines: Toute particule ISOLEE d’une taille supérieure au micron mais inférieure à 400 microns peut être considérée: Bactéries plaquettes chromosomes isolés (= cytogénétique en flux) Mitochondries Champignons unicellulaires, levures Leucocytes Phytoplancton Protoplaste végétal FDC

L’obligation d’obtenir des suspensions cellulaires monodispersées implique la destruction de l’organisation tissulaire: La perte du microenvironnement et des relations histologiques est un défaut majeur de la cytométrie en flux Solution: réaliser les mêmes études (sauf le tri) par la technologie complémentaire à la cytométrie en flux: La cytométrie d’images alliant microscopes , caméras, morphologie mathématique et informatique

PRINCIPES FONDAMENTAUX CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX ANALYSE TRI CELLULAIRE APPLICATIONS

Un cytofluorimètre-trieur à flux

Les cellules sont injectées en file indienne et traversent un laser Echantillon Le gicleur (« nozzle= tuyère ») Une cellule Injecteur Liquide de gaine Gicleur Les cellules sont injectées en file indienne et traversent un laser UNE à UNE. Fluorescence Faisceau laser Diffusion lumineuse, "Ombre portée" "Taille cellulaire" Liquide de gaine (diamètre 70 µm) + Veine porteuse (diamètre 10 µm) = Flux

FOCALISATION HYDRODYNAMIQUE

La grande force de la cytométrie est de considérer chaque cellule INDIVIDUELLEMENT Le cytomètre peut alors: Faire la différence entre un marqueur faiblement exprimé par une grande partie d’une population cellulaire et l’expression forte de ce même marqueur par une minorité de cellules Le cytomètre peut aussi: Détecter, analyser et trier des cellules rares dont l’intérêt biologique peut être considérable.

Cancérogenèse 10-15 ans 1 – 1000 cellules ?? XXX Millions cellules 10-15 ans FACTEURS ENDOGENES FACTEURS ENDOGENES MODULATION INITIATION PROGRESSION PROMOTION TISSU NORMAL CELLULES CELLULES INVASION "CIBLE" PRENEOPLASIQUES NEOPLASIQUES METASTASES 1 – 1000 cellules ?? XXX Millions cellules Cellules rares FACTEURS EXOGENES FACTEURS EXOGENES CARCINOGENES PROMOTION

Le cytomètre mémorise TOUS les paramètres de CHAQUE cellule considérée INDIVIDUELLEMENT dans une LISTE INFORMATIQUE (list mode) Une cellule différente de 10.000 à 30.000 autres cellules peut être retrouvée dans cette liste et analysée Dans ce graphique, chaque point représente UNE cellule: Sur 100.000 cellules, 14 cellules différentes sont repérées. Témoin Traité

Quels sont les paramètres étudiés en cytométrie ? 2) Les émissions de fluorescence (SI il y a une sonde excitable par le laser) Fluorescence Faisceau laser Diffusion lumineuse, La diffusion lumineuse « Scatters » (diffraction, réflexion, réfraction), TOUJOURS émise) "Ombre portée" "Taille cellulaire"

Les « Scatters » : une lumière diffusée DE MEME COULEUR que le laser incident, dont l ’intensité est proportionnelle à la taille (FSC) ou à la granularité (SSC) cellulaire. Diffusion lumineuse orthogonale: Texture cellulaire, La réfraction domine granularité. "Side Scatter, SSC" Diffusion lumineuse axiale: La réflexion et diffraction dominent. "Forward Scatter, FSC" Ombre cellulaire, taille relative de la cellule

Les scatters sont TOUJOURS émis, même en l’absence de fluorescence. FSC et SSC sont les deux paramètres discriminants fondamentaux. Le diagramme de dispersion (« Dot plot »)

reconnaitra un récepteur membranaire. Les Fluorescences sont émises dans TOUTES les directions; elles sont toujours de couleur différente de celle du laser. La couleur est fonction de la nature de la sonde fluorescente L ’intensité de fluorescence est proportionnelle au nombre de molécules- sondes fixées sur la cellule, et donc au nombre de récepteurs-cibles. Un anticorps « vert » reconnaitra un récepteur membranaire. Une sonde « rouge » quantifiera l ’ADN

700 600 478 438 672 500 400 300 800 nm Déplacement de Stockes ABSORPTION ET FLUORESCENCE DE PerCP (Peridinine chlorophyll –a-protein complex) a.u

FITC TR R-PE Tandem R-PE*TR PI 7-AAD B-PE APC PRINCIPAUX FLUOROCHROMES UTILISES EN CYTOMETRIE EN FLUX

Détecteurs SSC et fluos Les « Fluorescences » et « Scatters » sont SIMULTANEMENT émis dans toutes les directions. Par construction, le cytomètre « regarde » À zéro degré (FSC) et à 90 degrés (SSC et Fluorescences) Détecteurs SSC et fluos Détecteur FSC

Interprétation d ’un histogramme selon le paramètre mesuré 255 100 intensité relative nombre de cellules petites cellules grandes cellules structure homogène structure granuleuse brillance faible brillance élevée Diffusion axiale Diffusion orthogonale Fluorescence .

Le diagramme de densité (numérique): chaque carré représente un GROUPE de cellules, le nombre de cellules du groupe est donné par une FAUSSE COULEUR <10 10-100 100-500 500-2000 2000-5000 5000-10000 > 10000

La fenêtre R1 est VOTRE choix !!! Se tromper conduit à des analyses Invalides.

Le cytomètre –analyseur. Filtres optiques Détecteurs de fluorescences Miroirs dichroïques LASER Suspension cellulaire Liquide de gaine Chambre de flux Détecteur de diffusion orthogonale , SSC Détecteur de Barre d'obscuration Diffusion axiale, FSC Interception laser-Flux = Point d’analyse

Les filtres optiques:

FITC BP 520 BP 575 R-PE 620 520 575 488 Les filtres BP sélectionnent la bonne fluorescence et sont Le dernier rempart avant les détecteurs FITC BP 520 BP 575 R-PE Miroir Dichroïque DM 560 LP: Plaçé à 45°, Il est transparent Aux ondes < 560 nm et réfléchit les ondes > 560 nm 620 520 575 488

ALIGNEMENT LASER - FLUX Veine porteuse Une cellule 1,00 0,97 0,00 Laser #1 0,95 0,56 Laser #2 1,00 0,99 Laser #3

Alignement laser/flux et vitesse d ’injection: deux réglages fondamentaux A: optimal B: injection rapide C: flux désaligné D: bouchon

Détection et traitement des impulsions lumineuses. Chaque cellule, durant son bref passage dans le laser, émet un flash de lumière par paramètre étudié: Un flash de scatter axial et orthogonal (il existe des scatters sous d’autres angles, non considérés içi) Un ou plusieurs flash de fluorescences. Ces flash ou impulsions ne sont pas quelconques: Leur durée est égale au temps de passage de la cellule dans le laser (temps de vol moyen: 10 microsecondes) Leur intensité VARIE tout au cours de la traversée du laser !!!!

chaque cellule émet un « flash » de lumière Les impulsions: chaque cellule émet un « flash » de lumière dont l’amplitude maximale est atteinte au centre du laser et mesurée à cet instant… 10 niveau de seuil niveau de bruit de fond intensité Direction du flux section du faisceau laser une cellule Temps de vol (microsec.) Amplitude mesurée .

RESOLUTION ZERO La cellule est très petite comparée au laser: 10 niveau de seuil niveau de bruit de fond intensité Direction du flux section du faisceau laser une cellule Temps de vol (microsec.) Amplitude mesurée La cellule est très petite comparée au laser: Le cytomètre, qui n’est pas équipé d’un objectif de microscope puissant, ne peut pas faire la différence entre une fluorescence nucléaire et une fluorescence de surface: La cellules est considérée comme un point mathématique sans structure apparente. Le cytomètre « voit » la quantité totale de lumière émise par une cellule morphologiquement non résolue On dit que le cytomètre travaille à La résolution zéro. .

Le détecteur de « Scatter axial »(FSC): une simple photodiode. Filtre neutre 10% Barre D’obscuration Photodiode électrons Laser direct électrons FSC

Le détecteur de fluorescence: Un tube photomultiplicateur (PMT) un amplificateur de lumière: UN photon génère un million d’électrons. Tension PMT + 700 volts Photocathode Dynode Anode Un photon 10 6 électrons 0-1000 volts

Impulsion de scatter: Jamais nulle. LES IMPULSIONS LUMINEUSES SONT CONVERTIES EN IMPULSIONS ELECTRIQUES Impulsion de scatter: Jamais nulle. Volts (0-10) Impulsion de fluorescence élevée La fluorescence peut être nulle (=sous le seuil de détection) Temps de vol (microsec)

Le cytomètre: quelques chiffres…. Sensibilité: moins de 1000-3000 molécules fluorescentes par cellule. Soit moins de 300-1000 récepteurs antigéniques par cellule (un anticorps par récepteur et 3 molécules FITC par anticorps) Une cellule « positive » exprime en général de 50.000 à quelques MILLIONS de récepteurs cibles. Une cellule négative émet une AUTOFLUORESCENCE naturelle équivalent à 10.000-30.000 molécules FITC. Corollaire: une cellule déclarée « négative » peut en réalité exprimer un à plusieurs millier de récepteurs antigéniques, non détectés car situés sous le seuil de détection, ou sous le niveau d’autofluorescence naturelle. ==> La limite n ’est pas le cytomètre mais bien le matériel biologique. La sensibilité d’un cytomètre varie selon la nature des fluorochromes: Il sera plus sensible avec PE qui brille 40 x plus que FITC.

Linéaire ou logarithmique. Tension PMT + 700 volts 0-1000 volts Photocathode Un photon Anode Le GAIN: Une amplification secondaire Linéaire ou logarithmique. Dynode Amplification: 6 10 électrons Gain X1 à X16, Log Volts Seuil (Threshold) 10 Mesure Convertisseur Analogique => Digital 0 volts => canal 0 10.23 volts => canal 1.023 (ou 255)

AMPLIFICATION LINEAIRE: LE GAIN S’UTILISE COMME UN ZOOM 50 100 150 200 250 GAIN 2.5 GAIN 5.0 50 100 150 200 250

Populations Hors échelle en Mode LIN 4 1 2 3 10 10 10 10 10

Le seuil de sensibilité: Souvent posé sur le scatter axial (FSC), il permet au cytomètre de ne PAS « voir » des particules trop petites. Le seuil ne peut jamais être mis à zéro: à vérifier si votre cytomètre semble « aveugle »

des particules de taille donnée… mesurée Plaquettes Lymphocytes Volts 10 Amplitude Le niveau de seuil correctement ajusté permet de détecter, ou ignorer, des particules de taille donnée… mesurée niveau de seuil 10 Temps de vol FSC (microsec.) Volts 10 Amplitude mesurée niveau de seuil 10 Temps de vol FSC (microsec.)

Presque toujours placé sur FSC, le seuil peut parfois être posé sur une fluorescence, par ex. pour ignorer des cellules négatives majoritaires et repérer de rares cellules positives…par exemple pour les trier. Corollaire: vous ne pouvez plus calculer le % de cellules marquées, mais juste les repérer pour la pose d’une fenêtre de tri. Pour ignorer les trop nombreux débris nucléaires à faible teneur en DNA (de fluo non nulle !!!) et focaliser l’analyse sur les rares vrais noyaux (de fluo supérieure)

Résumé: PMT voltage, détermine l’amplification primaire Tension PMT + 700 volts 0-1000 volts Photocathode Un photon Anode Résumé: PMT voltage, détermine l’amplification primaire de la fluorescence 2) Le GAIN, Amplification secondaire LIN (DNA) ou LOG (Immuno) Les scatters sont souvent LIN 3) Le SEUIL: Toujours utilisé en Scatter FSC; parfois (jamais) utilisé en fluorescence Dynode Amplification: 6 10 électrons Gain X1 à X16, Log Volts Seuil (Threshold) 10 Mesure Convertisseur Analogique => Digital 0 volts => canal 0 10.23 volts => canal 1.023 (ou 255)

CLASSEMENT DES DONNEES Convertisseur Analogique => Digital 0 volts canal 0 Volts 10.23 volts => canal 1.023 (ou 255) 10 NOMBRE De cellules Mesure Classement 200 400 600 800 1000 INTENSITE LUMINEUSE RELATIVE (Pas d’Unité )

RESUME Le cytomètre ne capture que de la lumière Il sélectionne la couleur (longueur d’onde) grâce à des FILTRES Bleu = Scatters Vert, orange, rouge = Fluorescences 3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électrique À l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences) 4) Les signaux sont amplifiés à l’aide: du PMT voltage (uniquement fluorescences) du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters) 5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général) 7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues: !! cytomètre = voltmètre !! 8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique (LIST MODE) 9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate »)

VOUS Intervenez à tous niveaux Le cytomètre ne capture que de la lumière Il sélectionne la couleur grâce à des FILTRES Bleu = Scatters Vert, orange, rouge = Fluorescences 3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électrique À l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences) 4) Les signaux sont amplifiés à l’aide: du PMT voltage (uniquement fluorescences) du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters) 5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général) 7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues. 8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique 9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate ») VOUS Intervenez à tous niveaux

CONCLUSION: le cytomètre donne TOUJOURS des résultats, quelque soit son état !!! C’est de VOUS, qui intervenez à de nombreux niveaux, que dépend la validité des mesures. NE PAS SE LAISSER GUIDER PAR DES AUTOMATISMES PREPROGRAMMES SANS LES AVOIR COMPRIS.

Le cytomètre et le microscope: difficultés d’interprétations 100.000 Intensité relative Microscope Cytomètre à flux : 1 2 3 4 A B Faisceau laser large Faisceau laser mince . 50.000

L’Analyse multicouleur: le problème des compensations dans le couple FITC - PE

Le problème des fuites optiques: Les compensations de 2 couleurs . BP575/42 BP530/30 l Longueur d'onde (nm) Fluorescence (intensité relative) FITC émet une fluorescence de prédominance verte à nos yeux, et majoritairement détectée par le PMT 1. En réalité, l'émission se poursuit dans le rouge et contamine le détecteur PMT2: On parle de "fuite optique" ou de "contamination optique" qui touche TOUS les détecteurs à des degrés divers: en général, PMT2 reçoit 25 à 35% du signal PMT1 PMT2

BP575/42 BP530/30 l Longueur d'onde (nm) Fluorescence (intensité relative) PE émet une fluorescence de prédominance orange à nos yeux, et majoritairement détectée par le PMT 2. En réalité, l'émission commence dans le jaune-vert et contamine le détecteur PMT1, et continue dans le rouge et contamine un PMT3 éventuel.... On parle de "fuite optique" ou de "contamination optique" qui touche TOUS les détecteurs à des degrés divers: en général, PMT1 reçoit moins de 2% du signal PMT2. PMT1 PMT2 .

et chaque fluorescence on retranche la fraction contaminante que VOUS - P E B 5 7 / 4 2 3 L o n g u e r d ' ( m ) Fluorescence (intensité relative) La compensation électronique: Pour chaque cellule et chaque fluorescence on retranche la fraction contaminante que VOUS avez déterminée. FL1=FL1-2%FL2 FL2= FL2-30%FL1 UV IR 400 450 500 550 600 650 700

Pas de compensation Trop compensé Compensations optimales

Disproportion des signaux: Compensation difficile ou impossible PMT FL1= 900 V Mauvais !! Les PMT doivent être À un voltage plus ou moins Égaux. PMT FL2 = 550 V Plus de 70 % de contamination

PRINCIPES FONDAMENTAUX CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX ANALYSE TRI CELLULAIRE APPLICATIONS

Filtres optiques Détecteurs de fluorescences Miroirs dichroïques LASER Suspension cellulaire Liquide de gaine Chambre de flux Détecteur de diffusion orthogonale , SSC Détecteur de Barre d'obscuration diffusion Interception axiale, FSC Formation des laser-flux: gouttes: région d'analyse région de tri + + + Plaques de charge: -2500 Volts + +2500 Volts + + - - - Cellules triées Cellules triées Poubelle

Tri cellulaire: formation des gouttes Z Quartz Ao ro r .

AMPLITUDE et FREQUENCE La longueur de la partie intacte du jet est fonction de l’AMPLITUDE de l’oscillation que VOUS donnez au qartz: elle doit être la plus courte possible, mais pas au point de déformer les « scatters » La distance qui sépare deux gouttes (= l) Est fonction de la FREQUENCE de l’oscillation que VOUS donnez au qartz.

LE DELAI DE CHARGE: définition L’analyse d’une cellule ET la décision de tri se passent ici DELAI DE CHARGE d’une goutte = Le temps que met une cellule pour aller du point d’analyse à la formation de la goutte La même cellule sera enfermée dans une goutte qui se forme PLUS TARD: La charge de la goutte se fera ici 110 microsecondes séparent l’analyse du tri: C’est le temps que doit attendre le cytomètre entre analyse et tri d’une cellule donnée. La procédure est séquentielle, et non simultanée: pour chaque cellule il y a analyse et ensuite tri

ESTIMATION DU DELAI DE CHARGE Sommet du gicleur 0,25 mm Impact laser Distance 'D' mesurée Lien Distance 'D' Goutte n°1 l reportée ==> Délai de charge = temps de formation de 11.75 gouttes

La position d’une cellule dans le flux est incertaine ? Temps 0 Temps 1 A B Pour cette raison, on dévie un TRAIN de 3 gouttes successives pour chaque cellule triée: 1) la probabilité que la cellule désirée soit présente dans l’une des gouttes du train est très grande. 2) La probabilité qu’il y ait plus d’une cellule par train est faible mais n’est pas nulle: c’est une coïncidence qu’il faudra détecter et rejeter du tri.

L’onde de charge (A) et l’onde de fragmentation du flux (B) sont physiquement indépendantes: elles DOIVENT être mises en phase afin que chaque goutte soit correctement chargée puis déviée.

Gicleur Flux Champ électrique 3 jets cohérents: Multitude de jets: phase correcte déphasage important

Goutte principale Temps 1 Goute satellite Satellite lent… Temps 2 …rattrapé par La goutte principale

C A B T T e m e m p s 1 : p s T e m p s 1 : C h a r g e n u l l e C h a r g e n é g a t i v e C h a r g e n u l l e 1 S a t e l l i t e L i e n S a t e l l i t e l e n t 1 r a p i d e S a t e l l i t e l e n t r a t t r a p é p a r l a g o u t t e s u i v a n t e

TRI DE MASSE: ON RECOLTE UN MAXIMUM DE CELLULES THYMUS DE SOURIS ADULTE: TRI DES 4 SOUS-POPULATIONS DE CELLULES T C B A 3 D E

CLONAGE DE CELLULES PAR CYTOMETRIE EN FLUX: Lignée MP2 Lyt-2 (CD8) L3T4 (CD4) - + - + Clones 1 2 3 4

Le clonage démontre que la cytométrie en flux est une méthode Non destructive, la cellule est intacte et reste en vie … -Propre, les conditions d’aseptie peuvent être réunies….

Temps mort et coïncidences Temps mort du cytomètre: temps minimal incompressible, nécessaire à la détection, l’analyse et le tri d’UNE cellule Durant ce temps, le cytomètre est exclusivement consacré à ces tâches: Le traitement de LA cellule en cours. Si une seconde cellule arrive dans le cytomètre déjà occupé à traiter une première cellule, cette seconde cellule est dite « en coincidence » . La cellule en coincidence peut être détectée mais pas analysée (ni triée), ou même peut ne pas être vue du tout !!! Certaines coincidences sont détectables et bien gérées par le cytomètre qui rejettera du tri l’ensemble des cellules concernées: cas du train de gouttes à plus d’une cellule.

Agrégat: erreur Coïncidence d’analyse Coïncidence de tri Tout OK Coïncidences: Certaines cellules sont détectées mais pas analysées ou analysées mais pas triées… Ou ne sont JAMAIS VUES !!!

TRI DE CELLULES RARES: CONTRÔLE DE QUALITE 1% >99 %

PRINCIPES FONDAMENTAUX CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX ANALYSE TRI CELLULAIRE APPLICATIONS

Cytométrie à 3 couleurs: Double phénotype corrélé au DNA CD8 CD4

3 antigènes, LASER 3 anticorps. R-PE FITC (Strept)-Avidine Biotine FLUORESCENCE VERTE, Texas Red™ 520 nm Cellule ou Cyanines-5 FLUORESCENCE ORANGE, 575 nm FLUORESCENCE ROUGE, >620 nm TRANSFERT D'ENERGIE

Triple immunophénotype: Le diagramme de dispersion 3-D

Excitation: Emission: F I T C R - P E R - P E * T R A P C P e r C P 1 UNE COMBINAISON POSSIBLE D'ANALYSE SIMULTANEE DE 5 FLUORESCENCES PAR CYTOMETRIE EN FLUX - NECESSITE DE 2 LASERS. Excitation: Emission: F I T C R - P E R - P E * T R A P C P e r C P 1 5 6 7 l ( n m )

LE CYTOMETRE A DEUX LASERS FSC FITC APC SSC LASER #1 FLUX LASER #2

Deux fluorescences similaires (APC et PerCP) sont spatio-temporellement séparées dans un cytomètre bi-lasers. BP 530/30 Fluo-3 / Fitc BP 675/20 PerCP MD 560 LP BP 488/10 SSC MD 610 LP MD 90/10 BP 488/10 BP 575/30 FSC R-PE 1/2 miroir BP 670/14 APC Laser 1: 488 nm Laser 2: 647 nm Flux

Time-gating: le signal FL2 du laser 2 est séparé Spatio-temporellement des signaux FSC-FL1 du laser 1 Laser 1 FSC FL1 Laser 2 FL2 5 10 15 20 Microsecondes

Laser 1 FSC PerCP FL1 APC Laser 2 FL2 5 10 15 20 Microsecondes Time-gating: conséquence : APC de meme couleur de fluorescence que PerCP est néanmoins distinctement analysé car 20 microsecondes séparent les deux émissions ET que 0,25 mm séparent les deux impacts lasers sur le flux. Laser 1 FSC PerCP FL1 APC Laser 2 FL2 5 10 15 20 Microsecondes

Fluo-3/AM liposoluble 2+ incapable de fixer Ca Fluo-3/AM Estérases cellulaires Fluo-3 séquestration Fuites hydrosoluble, Mitochondries, fluorescence faible RE. 2+ 2+ [Ca ] [Ca ] i o 2+ Fluo-3-[Ca ] i fluorescence multipliée, X40

Les flux calciques