Méthodes d ’étude de la cellule

Cellule plus petite quantité de matière vivante capable de subsister à l’état autonome et de se reproduire.

Types cellulaires

La découverte de la cellule Historique La théorie cellulaire

La découverte de la cellule

Robert Hooke (1665) a inventé le mot cellule mais Antonie Van Leeuwenhoek a été le premier à observer réellement des cellules. Robert Hooke observe des petits trous dans l’écorce du chêne (liège) qui lui font penser aux cellules d'une prison. Il les nomme « cellules » et croit que seul le liège présente ces structures.s Cellules dans l’écorce du liège Microscope rudimentaire de Hooke Antonie Van Leeuwenhoek a été le premier à décrire des unicellulaires qu’il voyait dans des gouttes d’eau, mais aussi, des globules rouges sanguins et des spermatozoïdes.

La théorie cellulaire

En 1838, Matthias Schleiden, un botaniste, suggère que tous les tissus végétaux sont faits de cellules. Un an plus tard, le zoologiste Théodore Schwann en arrive à la même hypothèse au sujet des animaux. En 1855, Rudolf Virchow suggère que toute cellule provient d'une autre cellule, préexistante. Ces scientifiques ont mené à la théorie cellulaire  : 1. La cellule est la plus petite entité vivante. 2. Tout être vivant est composé de cellules. 3. Toute cellule provient d'une autre cellule. Source

ETUDE DE L’ORGANISATION CELLULAIRE ⇒ Techniques morphologiques Microscopiques  Cest l’examen d’objets (echantillon) agrandis

Les cellules possèdent un plan d’organisation Les 3 domaines du monde vivant Bactéries Archées Eucaryotes

Eléments inter cellulaire Cellule végétale Cellule animale Paroi cellulaire ou cellulosique (pectocellulosique) Vacuole plastes Membrane plasmiquE (Plasmalemme) Cytoplasme Noyau Mitochondries Réticulum endoplasmique (RE) Ribosomes Appareil de Golgi Lysosomes Cytosquelette Centriole

Les microscopes utilisent la déviation d’un flux ondulatoire (ondes) de particules, soit non chargées les photons, soit chargées électriquement les électrons à travers un système de lentilles de manière à former un objet à étudier une image agrandie.

Grossissement maximum microscope Photonique à lumière à UV Electroniques TEM SEM Limite de résolution 0, 2 µm 0, 1 µm 1nm 2 nm Grossissement maximum x 2000 X 150 000 X 30 000

Au microscope optique Au microscope électronique

Le microscope optique contient deux lentilles principales: l'objectif et l'oculaire. La lumière qui traverse la préparation passe successivement dans chacune de ces deux lentilles. L'image de l'objet y est, à chaque fois agrandie

Le microscope optique est un instrument où s’effectue un double grossissement. Une lentille donne une image primaire agrandie de l’objet, cette image est reprise et agrandie par une seconde lentille grossissante simple. ⇒ La lentille de l’objectif effectue le grossissement primaire et donne une image réelle. ⇒ La lentille de l’oculaire effectue le grossissement secondaire. Elle permet à l’oeil de former une image virtuelle agrandie de l’image réelle formée par la lentille de l’objectif.

OEIL OCULAIRE OBJECTIF

La préparation des échantillons

Observation direct sur cellules vivantes Observation indirect (cellules mortes (fixées) ♦ frottis ♦ coupes

Observation non colorés Observation colorés: Colorants vitales Colorants fixateurs

Colorants pour microscopie optique • rendent les membranes cellulaires et autres éléments de la cellule visibles au microscope • les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confère la coloration (groupement chromophore) est acide ou basique • réagissent avec les groupements ionisés des protéines, acides nucléiques et polysaccharides

Types de MO

Le microscope optique à fond noir possède un condenseur à fond noir et les rayons lumineux arrivent latéralement sur l’objet. La cellule apparaît comme un objet brillant sur le fond noir.

Le microscope à contraste de phase possèdent des systèmes optiques conçus pour exploiter les propriétés de diffraction des cellules vivantes. La lumière traversant les parties relativement denses ou épaisses de la cellule est retardée par rapport à celle qui traverse une région voisine plus mince. Il se crée ainsi des effets d’interférences produits par la recombinaison de ces deux séries d’ondes donnant des images fortement contrastées.

Images obtenues à l’aide de la microscopie optique ordinaire (A) et à contraste de phase (B)

Microscope electronique L’agrandissement des images peut atteindre 100.000 fois et plus.

Dans ces microscopes, le faisceau des photons est remplacé par un faisceau l’électrons émis sous vide, accélérés par une forte différence de potentiel et canalisés par une série de lentilles électromagnétiques.

Microscopie électronique À transmission À balayage

Microscopie électronique à transmission Les électrons non diffractés sont dirigés sur un écran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 􀃆 zone claire 􀂄 les électrons diffractés n’atteignent pas l’écran 􀃆 zone sombre sur l’écran 􀂄 grossissement = 1,000,000 (vs 1000X microscope optique) 􀂄 limite de résolution peut atteindre 0.2 nm

Microscopie électronique à balayage Le spécimen est vaporisé avec un métal lourd Le spécimen est balayé par un faisceau d’électrons Émission d ’électrons secondaires par le spécimen Produit une vue 3D du spécimen

Microscopie électronique à fluorescence

Cellules rénales du rat 1.0 micrometer spermatozoïdes

colorants pour microscopie électronique (Intensificateurs) En recouvrant la surface des membranes et organites, augmentent le contraste des structures irradiées avec les électrons Exemples: •Tetroxyde d’osmium • Acétate d’uranyle • Acétate de Pb, etc.

Préparation d’échantillons Utilisées pour étudier la structure de la cellule

Fixation Déshydratation Inclusion Coupe En microscopie optique ou électronique, la préparation comporte généralement 4 étapes: Fixation Déshydratation Inclusion Coupe

Méthodes cytochimiques Techniques de marquage cellulaire Utilisation de réactions chimiques qui vont permettre la mise en évidence de molécules particulières dans la cellule Ces techniques sont toutes basées sur l’emploi de microscopes optiques et électroniques

But des méthodes cytochimiques Etude des rôles des constituants celluliare Differentiation cellulaire les manipulations sont justifiées par les deux exigences de l’examen au microscope : Les objets à examiner doivent être minces Leurs différents éléments doivent présenter un certain contraste

ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES ⇒ Techniques analytiques 1 Procédés physiques ♦ Cytophotométrie ♦ Diffraction aux rayons X ♦ Cytophotométrie de flux 2 Procédés chimiques Cytochimie ♦ Cytoenzymologie ♦ Immunocytochimie 3 Methodes biochimiques 1 Fractionnement ♦ Ultracentrifugation ♦ Chromatographie ♦ Electrophorèse 2 Caractérisation ♦ Spectrophotométrie ♦ Hybridation moléculaire

Méthodes cytochimiques Non-spécifiques Spécifiques détectent un ensemble de molécules aux propriétés chimiques communes e.g.: ADN nucléaire détectent une molécule particulière e.g.: tubuline

(spécifiques ou non-spécifiques Méthodes de DÉTECTION (spécifiques ou non-spécifiques Méthodes radioautographiques Méthodes enzymatiques Méthodes fluorescentes

Méthodes enzymatiques Formation d’un dépôt opaque à la lumière ou dense aux électrons (microscopie optique ou électronique + densitométrie) Méthodes radioautographiques Formation de grains d’argent opaques à la lumière ou denses aux électrons électronique Méthodes fluorescentes Composé fluorescent (fluorophor e): spectrofluorométrie, microscopie à épifluorescence, microscopie confocale à balayage)

Méthodes cytochimiques spécifiques Immunocytochimie Hybridation in situ

IMMUNOCYTOCHIMIE Détection des protéines ou autres molécules • Sondes utilisées: anticorps dirigés contre une protéine particulière • anticorps primaire : appliqué sur des coupes de tissus 􀃆 reconnaissance de la protéine • anticorps secondaire : dirigé contre l’anticorps primaire et couplé à : • une molécule fluorescente (détectée par immunofluorescence) • une molécule radioactive (détectée par radioautographie) • une enzyme (détectée après incubation avec un substrat incolore qui se colorera après réaction) • Une particule opaque aux électrons (pour la MET) (e.g.: or colloïdal)

Immunocytochimie par fluorescence (immunofluorescence) CIBLE: ici une protéine membranair

Hybridation in situ Détection de séquences d’ADN ou d’ARN spécifiques • Les sondes sont des ARN ou ADN complémentaires aux séquences d’intérêt • Appliquées sur les coupes de tissus, puis visualisées par : ♦ radioautographie grâce aux nucléotides radioactifs présents dans la sonde ou ♦ immunocytochimie grâce à la présence de nucléotides couplés à la digoxigénine, alors détectée par un anticorps spécifique couplé à une enzyme ou à une molécule fluorescente.

Hybridation in situ Hybridation in situ: sondes fluorescentes (technique du “FISH”)

Méthodes cytochimiques non-pécifiques A) Détection de groupements chimiques présents dans toutes les protéines, les acides nucléiques ou les acides gras Ex. ♦La réaction de Milton : détection des radicaux phénoliques de la tyrosine. ♦La méthode de Feulgen (réactif de Schiff, groupements aldéhydiques) : acides nucléiques et certains glucides et lipides

Techniques cytoenzymologiques Détection d’ activités enzymatiques présentes dans toutes les protéines, les acides nucléiques ou les acides gras

Principe: Mise en évidence dans une cellule de protéines à activité enzymatique Transformation d’un composé soluble et incolore en un composé insoluble et coloré en présence d’une activité enzymatique particulière (phosphatases, estérases, oxydases..)

Les techniques immunochimiques Méthodes qualitatives Le but de l'immunochimie est de révéler une molécule biologique présente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps spécifiques.

Les techniques immunochimiques Immunohistochimie : l'échantillon est une coupe de tissu immunocytochimie : l'échantillon est une préparation cytologique

Méthodes directes Il est ensuite révélé par un anticorps marqué. On mesure la fraction liée qui augmente avec la concentration en antigène à doser

Dosages avec un excès de réactif : méthodes immunométriques Méthodes directes Dosages avec un excès de réactif : méthodes immunométriques

L es anticorps marqués avec la fluorescéine sont utilisés pour détecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utilisée en microscopie électronique. 

Association de la microscopie et l’immunichimie

Questions?

Q1: Quelle sont les organites qu’on distingue avec le microscope optique: Mitochondries cellule animale bacteries virus membrane plasmique

Q1: Quelle sont les organites qu’on peut distinguer avec le microscope électronique: Mitochondries cellule animale bacteries virus membrane plasmique

Deux brins d’ADN membrane plasmique Q3: La cellule procaryote est composé de: Mitochondries enveloppe nucleaire un brin d’ADN Deux brins d’ADN membrane plasmique

Q3: La cellule eucaryote est une cellule ………………….ou ……….., est composé de: Mitochondries enveloppe nucleaire un brin d’ADN Deux brins d’ADN membrane plasmique

Q3: Quels sont les étapes général d’une préparation cellulaire?

Q4: Quel est le principe et le role des méthodes cytochimiques