Validation de méthodes analytiques : Recherche et dosage des stupéfiants dans le sang dans le cadre de la sécurité routière O. ROUSSEL*, S. HERVE, P. HERARD, O.MESSINES, M. PERRIN Le département Toxicologie de l’IRCGN est régulièrement requis pour des confirmations de dépistages urinaires positifs réalisés par les forces de gendarmerie ou de police, ou pour la recherche de stupéfiants chez les conducteurs impliqués dans les accidents corporels de la circulation. L’évolution des exigences légales liée à la sécurité routière (arrêté du 5 septembre 2001) et des exigences de qualité nous a amenés à réévaluer nos méthodes de recherche et de dosage des stupéfiants dans le sang. Depuis 2002, notre stratégie de validation s’est largement inspirée des articles publiés dans STP PHARMA PRATIQUES. Forts de ces quelques années d’expérience, nous avons décidé d’évaluer, selon ce principe novateur (détermination du profil d’exactitude), nos méthodes de recherche et de dosage des stupéfiants dans le sang. Le plan de validation a nécessité des dosages répétés quatre fois, en conditions de routine, de quatre sangs surchargés de chacune des molécules d’intérêt par trois personnes du laboratoire (soit 3 séries de 4 niveaux à 4 répétitions avec leur gamme respective). Ce plan concilie les exigences de ce type de validation aux contraintes matérielles, pécuniaires et temporelles. Les résultats ont été, dans un premier temps, exploités selon des feuilles de calcul développées au laboratoire puis, plus récemment, selon le logiciel e-noval® v1.1. Les profils d’exactitude et de risque sont issus de ce dernier. Recherche et dosage des amphétaminiques La prise d’essai d’1 mL d’échantillon* additionnée des étalons deutérés, est extraite à l’aide d’un Toxitube A®. La phase organique est évaporée à sec, le résidu est solvaté puis dérivé à l’anhydride heptafluorobutyrique. 1 µL de la solution dérivée obtenu est analysé en CPG/SM. Le chromatographe employé est un SHIMADZU GC-17A / QP 5000, les composants sont élués dans une colonne JWS Ultra-1 (12m x 0,2mm x 0,33 µm), l’acquisition se réalise en mode SIM (single ion monitoring). Les résultats (et non les signaux !) déterminés par le logiciel d’exploitation du chromatographe sont directement exploités. Exemple de la MDMA : Mesure à 210 m/z Étalon deutéré à 213 m/z Le profil d’exactitude traduit graphiquement l’incertitude de mesure déterminée lors de la validation. Ces incertitudes sont calculées selon le principe de l’erreur totale. La limite inférieure de quantification a été déterminée à 19,85 ng/mL, la supérieure à été déterminée à 454,6 ng/mL. La limite de détection a été estimée à 7 ng/mL. Les amphétaminiques recherchés et dosés avec cette méthode validée sont : l’amphétamine, la méthamphétamine, la MDMA, la MDA, la MDEA et le MBDB. Recherche et dosage des cannabinoïdes Une prise d’essai de 2 mL d’échantillon* additionnée des étalons deutérés, est extraite après acidification par l’acide acétique à l’aide d’un mélange hexane/acétate d’éthyle. La phase organique est évaporée à sec, le résidu est solvaté puis dérivé au bis-triméthylsilyl-trifluoro-acétamide. 2 µL de la solution dérivée obtenue sont analysés en CPG/SM selon des conditions similaires à la méthode précédente. Exemple du THC : Mesure à 386 m/z Étalon deutéré à 389 m/z La limite inférieure de quantification a été déterminée à 3 ng/mL, la supérieure à été déterminée à 100 ng/mL. La limite de détection a été estimée à 1 ng/mL. Dans le cas précis du THC où les concentrations recherchées sont plus faibles, il a été décidé d’accepter une incertitude de mesure de 50% (CV~25%) plutôt que les 40% habituels (CV~20%). Les cannabinoïdes recherchés et dosés par cette méthode validée sont le THC, le 11 hydroxy-THC et l’acide 11 nor-THC-carboxylique. * généralement du sang total hémolysé. Recherche et dosage des opiacés et des cocaïniques Une prise d’essai d’1 mL d’échantillon* additionnée des étalons deutérés, est extraite à pH 9 par un mélange de chloroforme et d’isopropanol. L’extrait obtenu est contre-extrait par de l’acide chlorhydrique. La phase acide est neutralisée, tamponnée à pH 9 puis extraite par le mélange de chloroforme et d’isopropanol. La phase organique est évaporée à sec, le résidu est solvaté puis dérivé au bis-triméthylsilyl-trifluoro-acétamide. 1 µL de la solution dérivée obtenue est analysé en CPG/SM selon des conditions similaires aux méthodes précédentes. Exemple de la 6-MAM : Mesure à 399 m/z Étalon deutéré à 402 m/z Exemple de la BZE : Mesure à 361 m/z Étalon deutéré à 364 m/z La limite inférieure de quantification de chacune de ces molécules a été déterminée à 15,00 ng/mL, la supérieure à été déterminée à 500,00 ng/mL. La limite de détection a été estimée à 5 ng/mL. Les opiacés et cocaïniques recherchés et dosés avec cette méthode sont : la 6-MAM, la morphine, la codéine, la dihydrocodéine, la codéthyline, la cocaïne, la benzoylecgonine, le cocaéthylène, l’ecgonine méthyl ester Les profils de risque Il traduit le risque, en fonction du résultat déterminé, d’être en dehors des limites d’accep- tation que l’on s’est fixé à priori. Dans l’exemple ci-contre, à 15 ng/mL, il y a 5% de risque d’être en dehors des limites alors qu’à 50 ng/mL, ce risque est inférieur à 1%. Conclusion : Lors de la phase de validation, la mise en œuvre des méthodes sous leur forme finale (protocole de routine) a simplifié la compréhension du processus de validation aux opérateurs moins investis, tout en nous assurant des performances de ces méthodes au quotidien. Ainsi les graphiques obtenus nous informent directement et simplement de l’incertitude de mesure et des limites de quantification. La mise en œuvre de ce protocole a, par ailleurs, été simplifiée par l’emploi de feuilles de calcul préétablies puis par celui d’un logiciel dédié. Finalement, l’évaluation de nos méthodes de recherche et de dosage des principales substances stupéfiantes, selon le protocole décrit, a confirmé les qualités de celles-ci à répondre aux exigences de l’arrêté du 5 septembre 2001 ainsi qu’à celle que nous nous sommes fixée, à savoir incertitude de mesure inférieure à 40% (exception des cannabinoïdes à 50%). Bibliographie : Groupe de travail ACCREDITATION de la SFTA «  Aide à la validation des méthodes en toxicologie et suivi thérapeutique pharmacologique », A.T.A., XVII (3), supplément 1. Commission SFSTP. « Validation des procédures analytiques quantitatives. Harmonisation des méthodes », S.T.P. Pharm. Prat.., 2003, 13 (3) 101-38. Commission SFSTP. « Guide de validation des méthodes de dosage biologique », S.T.P. Pharm. Prat., 2002, 12 (6),317-36 Commission SFSTP. « Méthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques : stratégie de validation », S.T.P. Pharm. Prat., 1997, 7 (3) 169-94. Molinaro R. et al. « Analyse simultanée des principaux stupéfiants et métabolites dans le sang total », TOXICORAMA, 1997, IX (3), 183-96 Kintz P. et al. « Identification et dosage des cannabinoïdes dans le sang », TOXICORAMA, 1996, VIII (2), 29-33. Commission SFSTP. « Guide de validation analytique », STP Pharm. Prat., 1992, 2 (4), 205-26.